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1、1,细胞凋亡与检测技术,2,对于一个多细胞生物来说，要维持完整性和保持平衡性，凋亡是一个非常重要的生物学过程。多细胞生物的诞生、生长、发育、存活以及死亡，无一不伴随着细胞凋亡过程。,第一节 细胞凋亡的生物学意义及其相关基因,一、细胞凋亡的概念与生物学意义,3,Hayflick界限(Hayflick Limitation）,概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是 Hayflick界限。,癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞 细胞的增殖能力与供体年龄
2、有关 物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系,细胞的衰老,二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的 决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老,不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数,细胞在体内条件下的衰老,在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生;正常情况下终生保持分裂的细胞，其分裂能力是否随着有机体年龄的增高而下降？它们 会不会衰老？衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长;衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老;骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞增殖速度也趋缓慢.,衰老细胞结构的变化,细胞核
3、的变化：体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大；细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化；内质网的变化：衰老动物内质网成分弥散性地分散于核 周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了；线粒体的变化：通常细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大；致密体的生成：脂褐质，老年色素等 膜系统的变化：衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小。衰老细胞间间隙连接减少；细胞膜内（P面）颗粒的分布也发生变化（减少）。,7,细胞衰老的分子机理,氧化性损伤学说：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（ROS-O2-，OH-，H2O2），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。端粒与衰老
4、：发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的“有丝分裂钟”学说（Harley,1990）rDNA与衰老:酵母染色体外rDNA 环的积累，导致细胞衰老。沉默信息调节蛋白复合物与衰老：复合物存在于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNA转录。.,8,SGS1基因和WRN基因与衰老：SGS1基因和WRN基因同源,编码解旋酶;酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均9.5代:24.5代）;wrn突变引发早老症.发育程序与衰老:线粒体DNA与衰老:Sen-DNA(80年代);mtDNA突变积累与细胞衰老有关,细胞衰老的分子机理,9,死亡是生命的普遍现象，但细胞死亡并非与机体死亡同步。正常的组
5、织中，经常发生“正常”的细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。细胞死亡的方式通常有3种：细胞坏死（necrosis）细胞凋亡（apoptosis）细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）,(一)细胞死亡的方式,10,化学因素（如强酸、强碱、有毒物质）物理因素（如热、辐射）生物因素（如病原体）,(二)、细胞坏死（necrosis）,影响因素,11,2种病理过程酶性消化蛋白变性 参与此过程的酶，如来源于死亡细胞本身的溶酶体，则称为细胞自溶（autolysis）；若来源于浸润坏死组织内白细胞溶酶体，则为异溶（heterolysis）,坏死细胞的形态改变,初期 胞质内线
6、粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂中期 随着胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性，导致细胞结构完全消失，末期 细胞膜和细胞器破裂，DNA降解，细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应,坏死细胞的形态改变,细胞死亡 组织病理学的中心议题遭受缺氧，病毒感染和某些毒素的损害而导致的关键性终结点细胞死亡现象也是生命新陈代谢的固有本质 例如胚胎发育、正常组织更新，以及在增殖淋巴细胞群体中选择适当的克隆，这种细胞生理性死亡是种系发育史中早就存在的，有利于动物发育中的许多生命功能。,14,采用什么样的标准可以比较在不同情况下，不同类型
7、的细胞死亡呢？形态学,1972年Keer根据细胞发生了与坏死完全不一样的死亡过程而提出了细胞凋亡（Apoptosis）的概念。,15,结扎大鼠肝的左、中叶门静脉后周围细胞发生缺血性坏死由肝动脉供应区的实质细胞仍存活，只是范围逐渐缩小，其间一些细胞不断转变成细胞质小块，不伴有炎症在正常鼠肝中也偶然见到这一现象,Kerr实验,16,（三）凋亡Apo 从ptosis 飘零，落下Apoptosis凋亡 细胞象秋天的树叶一样凋落的死亡方式,17,凋亡的概念,指细胞在生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的、高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。,During deve
8、lopment of a multicellular eukaryotic organism,some cells must die.Unwanted cells are eliminated during embryogenesis,metamorphosis,and tissue turnover.This process is called or apoptosis.,凋亡是生物体普遍存在的现象,并非每个细胞都能走到终点，相当一部分细胞，甚至绝大部分细胞都会在中途凋亡,胚胎形成,衰老和损伤细胞的清除,自身反应性T淋巴细胞的清除,肿瘤的发生、发展和转归,干细胞,胸腺的T细胞95%存活不到成
9、熟T细胞阶段 原始和幼稚红细胞在骨髓中发生“原位溶血”,染色质聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内溶物释放，故不会引起炎症,凋亡细胞的主要特征,20,21,凋亡细胞早期,细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构,22,凋亡细胞中期,细胞核的染色质高度凝聚、边缘化,23,凋亡细胞晚期,细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体,24,凋亡小体1,25,凋亡小体2,26,凋亡小体3,27,细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：
10、早期的细胞核呈波纹状或呈折缝样部分染色质出现浓缩状态；中期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；晚期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体,凋亡细胞中仍需要合成一些蛋白质，但是在坏死细胞中ATP和蛋白质合成受阻或终止核酸内切酶活化，导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成约200bp整数倍的核酸片段，凝胶电泳图谱呈梯状凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化,细胞凋亡的生化特征DNA阶梯,31,32,33,34,凋亡的意义,由基因控制细胞有目的，有选择性的自我消亡过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础。生物适应环境的需要,蝌蚪尾巴的脱落 脊椎动物的神经系统的发育哺乳动物指（趾）的形成,使各种细胞的生
11、存时限达到平衡,35,36,小结 细胞凋亡与细胞坏死的区别,40,Apoptosis vs necrosis,41,42,细胞程序性死亡是胚胎正常发育所必需的 PCD和细胞凋亡常被做为同义词使用，但两者实质上是有差异的,细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）,PCD是一个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中，某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的，并受到严格控制的正常组成部分 凋亡是一个形态学概念，指与细胞坏死不同的受到基因控制的细胞死亡形式PCD的最终结果是细胞凋亡，细胞凋亡并非都是程序化的。,2002年10月7日英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰
12、苏尔斯顿，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究，获诺贝尔生理与医学奖,二、细胞凋亡的相关基因,（一）Fas受体是凋亡的主要引发剂,1、Fas受体基因 定位：10q23 结构：全长25kb 9个外显子 8个内含子 表达：跨膜蛋白 分布：外周血中活化的T、B细胞,又称作APO-1/CD95属TNF受体家族,46,2、Fas配体基因,定位：1q23 结构：全长8kb 4个外显子 3个内含子 表达：类膜蛋白,Killer lymphocytes produce Fas ligand Binds to death receptor protein Fas Clustered Fas prot
13、eins recruit adaptor proteins These bind procaspase 8 These activate downstream procaspases,inducing apoptosis,47,3、作用,Fas受体与Fas配体的相互作用启动了细胞凋亡的通路,当载有Fas配体的细胞相互作用时，载有Fas受体的细胞将会发生凋亡,Fas的聚集过程,Fas能形成同源三聚体三聚体在与配体作用前装配配体的作用可能是引起三聚体装配成更大的聚合体FasL作用Fas时，一个聚集过程能使Fas激活通路的下游,Fas forms trimers that are activated
14、 when binding to FasL causes aggregation.,49,Fas介导的细胞凋亡途径,Fas的特点 胞外区：三个富含半胱氨酸的胞内区：死亡结构域（Death domain，DD）,FasL与Fas结合Fas三聚化使胞内的DD区构象改变，然后与接头蛋白FADD的DD区结合,FADD的N端DED区（death effector domain）就能与Caspase-8（或-10）前体蛋白结合形成DISC(death-inducing signaling complex)引起caspase-8、10通过自身剪激活启动caspase的级联反应，使caspase-3、-6、-
15、7激活，这几种Caspase可降解胞内结构蛋白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡。,51,DISC Formation.,FasL的受体：TNF受体FasT淋巴细胞上的受体,相应的配体：一系列跨膜蛋白,表明存在着好几条通路，每条都被细胞-细胞的相互作用所启动，即细胞表面的“配体”与另一个细胞表面的受体作用。,Fas/FasL系统在免疫系统中的意义参与免疫调节活化成熟的外周T细胞主要通过Fas/FasL系统介导的细胞凋亡清除与自身抗原有交叉反应的克隆和由自身抗原激活的细胞克隆 以限制T细胞克隆的无限增殖，防止对自身组织的损伤，即产生外周免疫耐受。淋巴细胞凋亡异常导致的免疫耐受失控，是自身免疫性疾病的主
16、要病因,54,细胞毒T细胞（CTL）通过FasL诱导靶细胞凋亡 某些肿瘤细胞也可以通过这一途径诱导淋巴细胞凋亡，从而逃脱免疫监控。,Fas/FasL系统在免疫系统中的意义,Cytotoxic T-cell mediated killing of cells(for example,CTL-mediated killing of virus-infected cells)Deletion of activated T-cells at the end of an immune response Destruction of inflammatory and immune cells in imm
17、une-privileged sites,55,（二）、Caspase家族,半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。,特点：酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；总是在天冬氨酸之后切断底物，所以命名为caspase（cysteine aspartate-specific protease）都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。,56,ICE白介素-1 转换酶基因 能将白介素前体切割为活性分子在人类细胞中已发现11个ICE同源物2个亚族ICE亚族 参与炎
18、症反应CED-3家族 参与细胞凋亡,（Interleukin-1-converting enzyme）,CED-3家族 参与细胞凋亡执行者 caspase-3、6、7，可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化或自剪接的方式激活；启动者caspase-8、9，受到信号后，能通过自剪接而激活，然后引起caspase级联反应，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7,A：蓝色参与炎症反应，红色为执行者，绿色为启动者；B：caspase-3的结构模型；C：caspase-3的活化过程,58,59,60,61,IAPs（inhibitors of apoptosis
19、 proteins）属于一个庞大的蛋白家族能通过BIR结构域（baculovirus IAP repeats domain）与caspase结合，抑制其活性，如XIAP,caspase的抑制因子,Tian Le MA,Pei Hua NI,Jie ZHONG.et al.Low expression of XIAP-associated factor 1 in human colorectal cancersChinese Journal of Digestive Diseases 2005;6;1014,62,（三）、Apaf-1,Apaf-1称为凋亡酶激活因子-1（apoptotic pr
20、otease activating factor-1）在线虫中的同源物为ced-4在线粒体参与的凋亡途径中具有重要作用该基因敲除后，小鼠神经细胞过多，脑畸形发育,Apaf-1结构特点CARD（caspase recruitment domain）结构域，能召集caspase-9 ced-4 同源结构域，能结合ATP/dATP C端结构域，含有色氨酸/天冬氨酸重复序列，当细胞色素c的结合到这一区域后，能引起Apaf-1多聚化而激活。,64,Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，而这一过程又需要细胞色素c（Apaf-2）和caspase-9（Apaf-3）参与。Apaf-1/细胞色素c复合
21、体与ATP/dATP结合后，Apaf-1就可以通过其CARD结构域召集caspase-9，形成凋亡体，激活caspase-3，启动caspase级联反应。,65,（四）、Bcl-2家族,Bcl-2为凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白功能相当于线虫中的ced-9已发现至少19个同源物，它们在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体中细胞色素c等凋亡因子的释放。,66,1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4）有一个羧端跨膜结构域BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域BH3是与促进凋亡有关的结构域,Bcl-2的结构特点,跨膜结构,抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、B
22、cl-w、Mcl-1；促进凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，在促凋亡蛋白中还有一类仅含BH3结构，如Bid、Bad。,分类根据功能和结构可将Bcl-2基因家族分为两类,69,70,71,（五）p53,抑癌基因,功能是在G期监视DNA的完整性,72,如有损伤，则抑制细胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其调亡，,73,特点：17p13，11个外显子，10个内含子编码：393个氨基酸，53000,74,75,促进细胞增殖、抑制分化,（六）c-myc,能激活那些控制细胞增殖的基因激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖或凋亡,当
23、生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡,76,myc家族数量：c-myc,N-myc、L-myc、R-myc编码：3个外显子组成，Exon1不编码，缺少ATG，但 多个终止密码子；另外两个外显子表达62-64kDa或66-67kDa的蛋白 特点：位于核内，属于DNA结合蛋白类，与DNA复制 起动有关 作用：基因产物都位于细胞核内，可与某些特定DNA 相结合，影响DNA复制的起动过程或对转录进 行调控，从而实现其调节细胞生长、增殖、分化的目的。,78,79,80,81,Cytochrome CProcaspase aggregation and activation ca
24、n be triggered from within the cellMitochondria are stimulated to release cytochrome c,an electron carrier proteinBinds and activates cytosolic adaptor protein Apaf-1 This binds and activates procaspase 9 Caspase cascade is triggered Bcl-2 can block the release of cytochrome c,82,Apoptosis vs cell s
25、urvivalA cell dies as a result of:Signals that promote apoptosis Lack of signals that promote survival,83,第二节 细胞凋亡信号的传递,一、经典的信号传递途径（一）酶偶联受体介导的信号传递与细胞凋亡,1、受体活化蛋白激酶是细胞凋亡信号传递途径中重要的酶类其激活需要受体的活化,84,(1)生长因子类受体活化,结构特点:胞外区(配基结合区)跨膜区胞质区,85,受体,信号刺激,亚基聚合,胞质结构区的磷酸化,蛋白或激酶结合位点,86,(2)细胞因子受体活化,受体,配体,受体-配体,受体亚基聚合,胞质
26、内信号蛋白或激酶活化,酪氨酸磷酸化,受体活化,87,2.胞内信号级联反应,级联反应的分子基础:参与反应的受体以及一系列下游激酶或蛋白分子中的功能区,SH2:结构域介导信号分子与含酪氨酸磷酸化的蛋白分子结合SH3:介导信号分子与富含脯氨酸的蛋白分子结合PH:接受多种信号并将其传递至不同效应分子PTB:特异识别蛋白分子中Asn-Pro-X-Tyr序列,并与磷酸化的酪氨酸结合,88,3.酶偶联受体介导的信号传递与细胞凋亡,受体-ras-MAP途径,89,二、G蛋白偶联受体介导的信号传递与细胞凋亡,cAMP途径,Ca2+途径,cAMP途径,细胞,激素、细胞因子、化学物质,G蛋白,-GDP,-GTP,腺
27、苷酸环化酶,激活,cAMP增加,蛋白激酶A磷酸化,内源性核酸内切酶,DNA裂解，细胞凋亡,91,Ca2+途径,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,激酶磷酸化,细胞：分化凋亡,激素药物,酪氨酸激酶磷脂酶,IP3活性氧,92,第三节 细胞凋亡与人类疾病,一、肿瘤与细胞凋亡,二、系统性红斑狼疮（SLE）与细胞凋亡,SLE的免疫学特征：自身抗体的产生 抗DNA抗体抗核糖体抗体抗组蛋白抗体,SLE病人,凋亡的淋巴细胞增加且释放凋亡小体,抗核小体抗体,完整的核小体或亚核小体,吞噬功能降低,凋亡小体膜破裂,核小体释放入血,刺激产生自身抗体,94,三、肾脏疾病与细胞凋亡,1、肾移植排斥反应与细胞凋亡,CD
28、+淋巴细胞,移植肾小管上皮细胞,表达TIA-1,细胞毒T淋巴细胞,分泌：颗粒酶B、穿孔素、TIA-1,攻击移植肾小管上皮细胞凋亡：小管萎缩,95,2、肾小球肾炎与细胞凋亡,急性肾小球肾炎,中性粒细胞浸润,系膜细胞增殖,细胞凋亡,脱颗粒机会减少,巨噬细胞吞噬,有效肾单位减少,96,4、老年性痴呆与细胞凋亡,老年性痴呆,神经病理学和神经生化改变,神经元细胞减少 神经元纤维缠结神经炎症,脑内免疫炎症细胞凋亡,IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、TNF,ICE白介素-1 转换酶基因,97,第四节 细胞凋亡的形态学与生物学特征,98,第五节 细胞凋亡的检测技术,形态学生物化学免疫化学组织化
29、学分子生物学,99,一、细胞凋亡的形态学检测技术,（一）非染色光学显微镜检测技术1、普通光学显微镜法,坏死细胞：体积增大细胞膜损害或裂解网状的染色体,细胞凋亡：体积变小变形细胞膜完整发泡凋亡小体,100,2、电子显微镜观察法,凋亡细胞,体积变小 细胞质浓缩细胞核变小 染色质浓缩并凝结成块晚期凋亡小体,101,（二）染色法光学显微镜检测技术,染色方法：苏木素（HE）染色法姬姆萨染色法甲基绿-派诺宁染色法,细胞核：蓝色胞浆：淡红色染色质：致密浓缩凋亡小体,102,（三）荧光染料染色-流式细胞测定,碘化丙啶（PI）：只能使坏死细胞染色 显示：红色双苯并咪唑（hoechst33342）：可穿越细胞膜对
30、活细胞和凋亡细胞的DNA染色 显示：蓝色,103,1、双苯并咪唑染料吸收法,结果：凋亡细胞蓝色荧光明显强于活细胞和非凋亡细胞光散射能力降低坏死细胞PI复染呈现红色荧光,凋亡细胞,正常细胞,坏死细胞,104,105,2、碘化丙啶（PI）排斥分析法,先用PI染色、再用Ho染色,结果：坏死细胞呈现红色荧光活细胞Ho蓝色荧光最强,凋亡早期：蓝色荧光变弱，弱红色荧光,凋亡晚期：PI红色荧光变强,106,二、细胞凋亡的生物化学检测技术,（一）细胞群染色体DNA片段的检测技术,凋亡细胞：间隔梯状条带坏死细胞：模糊片状条带正常细胞：点样处大片段,107,（二）其他技术,1、标记与离心技术,3H-TdR或125
31、I-UdR,离心,低分子量DNA,高分子量DNA,测定放射活性,108,2、细胞凋亡的钙离子浓度测定,109,三、细胞凋亡的分子生物学检测技术,（一）末端转移酶介导的标记技术 1、生物素-dUTP/酶标亲和素测定,生物素-dUTP,TdT,掺入凋亡细胞的3-OH,亲和素-过氧化物酶,显色,110,正常细胞,凋亡细胞,结果：,正常细胞：没有DNA的断裂，没有3-OH末端被标记。显微镜下无显色,2、生物素-dUTP/荧光标记3、Cy5-dNTP标记4、细胞表面蛋白质的标记,112,（二）切口平移标记技术,凋亡细胞,DAN单链断裂,3-OH切口,DNA聚合酶I,放射性同位素 非放射性标记物,检测,113,四、细胞凋亡的免疫学检测技术,正常：染色体被组蛋白包绕形成核蛋白复合体,凋亡：产生的DNA片段仍被组蛋白包绕,114,抗组蛋白抗体,抗DNA抗体,115,五、细胞凋亡组化染色,116,117,1、细胞凋亡与细胞坏死的区别,名词解释1、细胞凋亡,复习思考题,简述题,
