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1、基于液相色谱-串联质谱技术的治疗药物监测方法研究进展2024摘要液相色谱-串联质谱技术具有高特异性、高通量的特点，因此在临床检验领域有快速的应用和发展，其在治疗药物监测中的应用可有效提升定量准确性与灵敏度，为患者制定个性化的最佳给药方案。但该技术目前仍面临一些挑战，自动化、质量控制、量值溯源等将是今后的发展方向。自20世纪90年代始，临床医学检验需求与技术快速发展，液相色谱-串联质谱(liquidchromatography-tandemmassspectrometry,LC-MS/MS)技术在治疗药物监测(therapeuticdrugmonitoringJDM)领域的应用愈加广泛。常用的T
2、DM方法分为光谱法、色谱法和免疫分析法。光谱法检测成本低,但所需样本量大，且易受代谢物或结构相似化合物干扰。色谱法适用范围广、定量准确度和精密度高，主要分为气相色谱法和液相色谱法。气相色谱法与气质联用法用于测定在一定温度下可气化且不分解的物质，因此应用范围受限。高效液相色谱法的样品前处理步骤耗较长，超高效液相色谱法所需进样体积及溶剂消耗小，但前处理流程更为复杂。免疫法基于抗原抗体的特异性结合进行检测，其中酶放大免疫法和荧光偏振免疫分析法应用最广。该法操作流程简便、自动化程度高，多用于临床大批量样本的定量。但其测定物质单一、较高的检出限与检测成本极大程度地制约了临床中低浓度药物的定量和多药高通量
3、检测的发展。LC-MS/MS技术具有高准确度、高灵敏度的特点，可区分结构类似物，交叉反应较小，已成为TDM分析的新选择。一、LC-MS/MS技术应用于TDM的方法类别（一）液相色谱-三重四极串联质谱法液相色谱-三重四极串联质谱法，已广泛应用至各类药物的TDM中，如免疫抑制剂、抗生素、抗真菌药、抗癫痫药、抗抑郁药、抗精神病药、抗凝血药、抗癌药。该法所用仪器成本相对较低，内部的三重四极杆结构被称为定量的最佳选择。其特有的多反应监测功能，可在同一样品运行时间内监测多个化合物的离子对，有利于实现各类药物的高通量检测。（二）液相色谱-四极离子阱串联质谱法应用最多的是线性离子阱复合三重四极杆质谱，其内部的
4、第三级四极杆被线性离子阱替代。Margaryan等使用线性离子阱复合三重四极杆在3.8min的色谱运行时间内测定了人血浆、脑瘤和脑脊液样品中的LY3214996（一种细胞外调节蛋白激酶抑制剂1阿贝西利（一种细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂）以及阿贝西利活性代谢物M2和M20的总浓度和未结合浓度。新型国产四极杆-离子阱质谱仪使用离子阱替代三重四极后端的碰撞池和第三极四极杆，其性能参数与线性离子阱复合三重四极杆相当，但其结构更为精简，目前已用于定量人血清中的25-羟基维生素D和万古霉素。该系统除定量外同样拥有多级碎裂功能，从多级碎裂角度区分质荷比相同的二级子离子，未来可用于鉴别液相色谱无法分离的同分异构
5、体，例如筛查和鉴别体内诸多药物代谢物研究。（三）液相色谱-高分辨质谱法美国食品药品监督管理局将质荷比分辨率10000的质谱定义为高分辨质谱”（highresolutionmassspectrometry,HRMSHRMS主要包括静电场轨道阱（orbitrap）质谱仪和四极杆飞行时间（quadrupoletimeOfflight,Q-TOF）质谱仪。在TDM过程中，HRMS常以全扫描模式操作，其中定量（药物浓度）和定性（药物代谢物、降解物、生物标志物和配方材料）信息可以在一次数据采集中收集，并对样品进行回顾性分析。例如，通过在先前获得的数据中提取目标质荷比来搜索降解产物或代谢物,为临床医生提供关
6、键信息。Nguyen等使用LC-Q-TOF和LC-Q-Orbitr叩测定了血浆和血清中的Rendomab（一种新型单克隆抗体药物），样品仅需沉淀蛋白后加入胰蛋白酶消化。当药物浓度为100ng/ml时，LC-Q-TOF和LC-Q-Orbitrap获得了较好的灵敏度，因此高分辨平台在定量复杂基质中的单抗药物时具有相应优势。Schuster等开发和验证了一种同位素稀释液相色谱-高分辨质谱法，用于检测11种广泛使用的全身抗真菌药。他们认为HRMS可以替代串联质谱技术，作为小分子药物TDM的一种新方法。虽然OrbitrapHRMS成本较高，但可以快速开发方法，因为在全扫描模式下不需调谐质谱参数,且使用H
7、RMS对质荷比极其相似的分析物或代谢物进行定量，无需液相进行良好分离。综上所述，液相色谱-三重四极串联质谱法因其定量能力强、灵敏度高、所需仪器设备价格相对较低的特点而广泛应用于临床实验室的定量工作中。但当液相色谱无法分离定量离子对相同的同分异构体时，其就失去了相应的优势。液相色谱-四极离子阱串联质谱法除定量之外还可实现多级碎裂，用于鉴别药物中的同分异构体，即使产物离子质荷比相同，也可通过指纹图谱中的各产物离子丰度比来区分化合物。但离子阱具有的空间电荷效应导致质荷比较小的离子碎片难以被观测到，因此可扫描的质量动态范围不高。液相色谱-高分辨质谱法可用于药物代谢研究，该法可获得化合物的准确相对分子质
8、量，有助于推断其在体内进行了何种代谢反应，探明代谢通路，若质谱仪质量准确度小于5ppm时还可推出该化合物的分子式，但HRMS较高的价格相对限制了它的广泛应用。二、LC-MS/MS技术应用于TDM的各类药物由于部分药物治疗窗窄，患者间存在个体差异，且药物暴露量受多种因素影响，因此需要对患者进行TDM,以达到提高药物疗效，减少或避免产生毒副作用的目的。(一)免疫抑制剂由于临床用药策略向最小治疗浓度方向发展,免疫抑制剂是将LC-MS/MS作为TDM分析工具后，在临床实验室中被监测的第一类药物。临床中也常使用化学发光微粒子免疫法和酶放大免疫测定法进行测定。体内产生的活性代谢物与药物自身结构类似，导致免
9、疫法易发生非特异性交叉反应，使定量结果普遍偏高。他克莫司(tacrolimuszFK506环抱菌素A(CiclosporinA,CsA西罗莫司(Sirolimus,SRL)、霉酚酸(mycophenolicacid,MPA)类衍生物是器官移植手术后最常使用的免疫抑制剂。CsA与FK506均为钙调磷酸酶抑制剂，其中FK506与FKBP12形成复合物，可抑制钙依赖性和非钙依赖性的白细胞介素-2及其他细胞因子所传递的细胞信号，抑制T细胞内蛋白质的合成。SRL作用机制与FK506类似，其形成的蛋白复合物可抑制钙依赖性和非钙依赖性的各类细胞因子所传递的细胞信号与增殖信号，抑制T细胞由G1期向向S期生长。
10、MPA是吗替麦考酚酯和麦考酚钠肠溶片的主要活性成分，是一种抗细胞增殖抑制剂。MPA通过抑制次黄瞟岭核昔酸脱氢酶而限制鸟瞟岭核甘酸的合成,进而阻断DNA的合成。FK506、CsA.SRL均可与红细胞结合，其与红细胞和在血浆中分布的比例为30：1,因此在通常情况下，需要采集静脉全血进行分析。由于全血基质复杂，因此常采用同位素稀释质谱法进行定量。干血斑采样量少，较血液样本更易储存，且成本更低，因此其应用越来越广泛。Gong等建立了一种全血中4种免疫抑制剂的高通量LC-MS/MS检测方法，样品采用一步沉淀蛋白法处理,7min内即可有效洗脱4种化合物。Koster等测定了干血斑中的免疫抑制剂，并对FK5
11、06和CsA的干血斑和全血样本均进行测定，表明这2种基质的定量结果并无差异，干血斑更适用于家庭采样后送检。(二)抗菌药物在以往的TDM策略中，其首要目的是为了预防药物产生的毒性反应。对于抗生素类药物来说，其最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)是药效学指标中的核心。该类药物的疗效同时受病原体的MIC及药物在患者体内暴露浓度的影响。对于时间依赖性抗生素,如-内酰胺类、青霉素类和碳青霉烯类抗生素，其游离药物浓度超过MIC的时间是最重要的药代动力学/药效学指数。因此，其给药的间隔时间和频率都极为重要，维持恒定的游离药物浓度是最佳的治疗策略。对于浓度依赖性
12、抗生素，如氨基糖苗类，通过其最大血药浓度与MIC的比值衡量其药效，防止耐药。目前，TDM应用最广泛的抗生素为氨基糖苗类和糖肽类。氨基糖苗类抗生素如阿米卡星、庆大霉素等，其治疗窗狭窄，易产生耳肾毒性，因此医生治疗时常选择较低给药剂量，导致体内暴露浓度过低而难以产生治疗效果。糖肽类抗生素以万古霉素为代表，该药对肾脏有明显毒性，当与耳肾毒性药物（如氨基糖苗类）合用，或肾功能减退者用药时，以及长期用药时进行TDM十分有必要。Barco等仅需50l血浆即可分析14种抗生素和一种B-内酰胺酶抑制剂。阿米卡星、万古霉素清除率与肌酊清除率高度相关，2种药物的血浆浓度以及肌醉浓度还可为建立群体药动学模型提供数据
13、支持。三嗖类药物抗真菌药主要包括伏立康嗖、泊沙康嗖、伊曲康嗖,该类药物在大剂量给药时可能导致药物蓄积而引起毒副作用。伏立康嘤由于基因多态性，可在患者体内产生快代谢或慢代谢，体内暴露浓度差异较大。肝功能损伤的患者需调整伊曲康嘤给药剂量后进行TDMoPrommas等测定了血浆中伏立康嘤的含量,并用于肝肾损害或CYP2C19代谢酶功能降低患者的TDM,同时采样量小的微透析法还可提高婴儿群体接受监测的依从性。()抗癫痫药物癫痫作为一种常见的精神系统疾病，因其具有高频复发的特点因而需要患者长期服药。第一代抗癫痫药(antiepilepticdrug,AED)苯妥英钠、卡马西平、丙戊酸的治疗范围狭窄，易出
14、现药物不良反应。这三种药物与血清白蛋白结合率较高，因此增加给药剂量极易导致游离浓度翻倍，产生毒性反应,故需要密切监测血药浓度。新一代药物拉莫三嗪、左乙拉西坦、奥卡西平、托毗酯、加巴喷汀均具有较小的副作用。由于抗癫痫药在临床中常多药联用，因此使用LC-MS/MS同时定量多个化合物为最佳选择。Davis等使用LC-MS/MS法同时定量人血清中的14种AED,又通过液相色谱-漂移管离子迁移质谱法测定精确的质量和碰撞截面值，区分了AED各种异构体和结构相似的代谢产物，提高了定性检测的可信度。其中液相色谱-漂移管离子迁移质谱法还可识别临床中未报告的AEDoLiu等开发并验证了一种采用极性切换和定时选择反
15、应监测的LC-MS/MS方法f同时对人体血浆中的8种抗癫痫药和1种活性药物代谢物进行定量，适用于服用一种或多种AED的患者群体的TDMo(四)抗抑郁药物根据中国精神科治疗药物监测临床应用专家共识(2022年版),5-羟色胺再摄取抑制剂帕罗西汀、三环、四环类抗抑郁药阿米替林与去甲替林被列为强烈推荐进行TDM的药物。建议对抗抑郁药的母体和代谢物进行同时监测，因为二者都对治疗效果和毒性作用均有贡献，它们之间的比例也可说明药物暴露的时间以及是否发生了治疗性或过度摄入。Degreef等建立了一种高效的LC-MS/MS方法,用于同时测定血浆中的40种抗抑郁药总色谱运行时间12min,监测每个化合物的三个离
16、子对，校准曲线范围包括亚治疗浓度到毒性浓度，且建立的方法根据欧洲药品管理局的生物分析方法验证指南和补充建议得到了充分验证，其目的是为了表明所建立的LC-MS/MS方法与前处理方法具有较高的准确性与可靠性。Shin等定量了用口腔液体收集装置采集唾液样本中的18种抗抑郁药，使用联苯柱在5min内即可分离待测物，适用于在临床实验室中快速定量。（五）抗精神病药物非典型抗精神病药如奥氮平、氯氮平被强烈推荐TDM,其最主要的原因是患者服药依从性差。为防止患者假服药、藏药或过量使用药物，TDM是最有效、能保证其正常生活状态的监测手段。新型抗精神病药物的血药浓度个体差异极大，这可能与不同患者体内药物代谢酶P4
17、50的基因多态性有关。多种药物（如氯氮平、奥氮平和利培酮）是CYP2C19.CYP1A2和CYP2D6的底物，当多药联用时，药物之间的相互作用会使患者血药浓度发生较大的波动。有些抗精神病药的长效制剂，如利培酮和阿立哌嗖在肌注之后吸收缓慢，其平均表观吸收半衰期可达4周,应在下一次注射前进行TDMo若出现意外药物不良反应，应随时进行TDM。Couchman等建立了一种高通量分析方法，在仅36S的总分析时间的定量人血浆中的氯氮平，并与5min的常规LC-MS/MS方法对比,结果一致。SteinhOrSt等使用分散液液微萃取法处理了血浆样品，同时测定了利培酮和其活性代谢物帕利培酮。（六）抗癌药物除传统
18、的抗癌药5-氟尿嚓D定和甲氨蝶吟（methotrexate,MTX）外，替尼类和单抗类药物也逐渐进入TDM的视野。临床上常使用大剂量MTX联合亚叶酸钙解救用于治疗骨肉瘤、非霍奇金淋巴瘤等恶性肿瘤。MTX可经肝醛氧化酶氧化生成7-羟基甲氨蝶岭(7-hydroxymethotrexate,7-0HMTX),但越来越多研究表明7-0HMTX体内浓度水平与大剂量MTX给药后的急性肝脏毒性相关，因此同时监测MTX和7-0HMTX的含量在临床中具有重要意义。5-氟尿喀碇作为一种广谱抗细胞代谢药，其基于体表面积的给药方式使约10%20%的患者血药浓度高于靶向范围易产生不良反应。对血清/血浆样品蛋白沉淀后,采
19、用简单的液液萃取提取样品后经LC-MS/MS系统分析。作为酪氨酸激酶抑制剂的替尼类药物，其中伊马替尼用于治疗胃肠间质瘤和黑色素瘤，但其具有高蛋白结合率，易导致人体内的暴露浓度呈翻倍式增长从而引起药物不良反应。达沙替尼稳态血药谷浓度较低，因此LC-MS/MS法为最佳检测手段。目前已有报道对色瑞替尼、伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、阿法替尼、厄洛替尼、吉非替尼进行监测。单克隆抗体个体暴露差异大，通过非特异性途径消除，且药物处置个体差异明显，需要对患者进行TDMe传统采用酶联免疫法，该法可进行高通量分析，但由于定量范围窄，只能测定单抗的游离形式而限制了应用。帕博利珠单抗可阻断细胞内PD-1通路，使淋巴
20、细胞重新激活，适用于治疗黑色素瘤。Millet等使用OrbitraPHRMS测定了其在70例癌症患者血浆中的浓度。曲妥珠单抗代替人表皮生长因子附着在乳腺癌细胞上并阻止其生长,可治疗乳腺肿瘤。Bults等使用50l血浆测定了曲妥珠单抗的特征肽及其脱酰胺肽。在定量药物浓度的同时，发现该药在其互补决定处脱酰胺可能损害其药理活性及测定结果的准确性。（七）抗凝血药物抗凝血药是防止血栓形成的关键性药物。华法林为香豆素类抗凝药，其通过抑制肝脏内凝血酶原和凝血因子的合成起到抗凝作用，主要用于心脏瓣膜置换术后患者的抗凝治疗。但其用药剂量易受到饮食、联合用药等因素影响，因此使用华法林时需要监测国际标准化比值以评估
21、疗效，预防出血。Xa因子抑制剂包括主要阿哌沙班、利伐沙班、依度沙班。达比加群酯是11a因子抑制剂，口服后转化为具有生物活性的达比加群。在患者处于特殊生理状态和特殊临床情况（如反复栓塞、严重出血）时需要对这两类凝血因子抑制剂进行TDMoHe等对15名参与者连续5d使用LC-MS/MS和抗Xa因子活性检测法定量了血浆中依度沙班的浓度，实验数据表明二者测定的结果高度相关。肝素类药物属于胃肠外抗凝药。由于低分子肝素安全性高，临床使用率高，但对于肌酊清除率低、处于妊娠期以及有严重出血倾向的患者，则需要TDM。（八）中毒药物筛查常由于误服、滥用等原因易导致患者药物中毒，因此建立一种简单、快速筛查、鉴定和定
22、量体内中毒药物的分析方法是临床抢救与治疗的重中之重。在进行中毒药物筛查时，首先应分析中毒患者的临床病理特征，缩小可能涉及的物质范围后，再采用更为具体的方法进行鉴定。筛查的首选样本是尿液，因为其有毒化合物的浓度通常较血清更高，干扰物较少。缺点是大多数药物或其他毒素会代谢生成亲水衍生物，由肾脏排泄。因此，临床实验室的质谱图库中还需包含化合物的代谢物，但这些代谢物不能通过商业途径获得，必须由实验室自行提取和鉴定。在LC-MS/MS系统采集数据时,常使用信息依赖性扫描(informationdependentacquisitionJDA)模式。典型的IDA方法在进行多反应监测的过程中，当仪器发现任何一
23、个离子对通道出现色谱峰时，根据用户设置，将对该通道的母离子采集二级质谱图数据，以便于在已建立的谱库中搜集数据并比对，从而鉴别化合物。精神科常进行中毒药物筛查，其原因是精神疾病患者常因病情未得到控制而缺乏认知能力，未遵医嘱服药从而导致药物中毒。目前已有学者对阿片类药物-47700和美沙酮导致的中毒及过量致死分别进行了动物模型研究和LC-MS/MS毒理学分析。李鹏飞等曾对高通量筛查药物中毒的224例病历进行回顾性分析，发现检出药物主要以镇静催眠药为主。三、LC-MS/MS技术应用于TDM的样本前处理方法人体液样本基质复杂，内含大量内源性蛋白质、脂质和其他小分子物质，且样本前处理通常是整个分析过程中
24、最为繁琐耗时的步骤，因此需要建立合适的前处理方法，并在这一过程中最大限度地去除内源性物质干扰，同时提取和富集待测物。(一)传统前处理方法当前文献报道常用的前处理方法有液液萃取(liquid-liquidextraction,LLEX蛋白沉淀和固相萃取(solidphaseextractionfSPE工1.LE基于不同物质在相应溶剂中的溶解度不同的原理进行提取。Namdev等分别使用二乙醛和二乙酸-甲基叔丁基醛-丙酮(50：30:20xv/v/v)分别从血浆和干血斑中提取抗癫痫药拉莫三嗪。但在同时定量多种化合物时,选择一种充分提取和回收所有化合物的溶剂，以及确定合适的提取PH值是较为困难的。且该
25、法所需操作时间较长、有机溶剂消耗量大以及样品受污染风险较高使得LLE法的应用逐渐减少。蛋白沉淀通过加入甲醇、乙睛等有机试剂以及硝酸银、三氯乙酸和高氯酸等沉淀蛋白，无需浓缩，处理步骤简单省时，是当前最为常用的前处理方法。但其缺点是处理后的样本较LLE会产生更多的干扰物。SPE基于固体色谱填料颗粒对不同成分的保留程度不同而对其进行化学分离，适用于受基质效应影响大，检测灵敏度低的物质。其中离线SPE较为常见,这一步骤在进入LC-MS/MS系统分析之前进行。而在线SPE通过六通阀连接SPE柱与LC-MS/MS系统。样品在SPE柱中保留并浓缩后，随即进入液相系统中进行洗脱。对于血浆或血清样品，使用乙睛或
26、甲醇沉淀蛋白，将离心后的上清液注入系统中，代替手动活化、萃取与洗脱，减少人工操作步骤以提高样本分析效率。目前已应用于精神类药物、抗癫痫药物的样本前处理。（二）基于新型纳米材料的前处理方法目前越来越多的新方法被不断应用于样本前处理，如分子印迹、金属-有机框架、超滤、固相微萃取等。其中新型纳米材料成本低廉、易于合成、稳定性强、可再生及拓宽检测范围的特点，使其在样品前处理中具有强大的应用潜力。分子印迹聚合物通过与待测物结构类似或相同的模板分子，在聚合物表面形成印迹空腔，从而可对待测物表现出接近于生物抗体的识别性。Banan等制备了2种分子印迹聚合物材料，一种制备后装入SPE小柱，另一种以Fe304为
27、磁核，在表面包覆SiO2,均用于提取人血浆中的胺碘酮。daSilva等制备了一种分子印迹聚合物，可富集人血浆中的苯笏醇，采用响应面法对合成参数进行优化，并成功对两名志愿者血浆中的药物进行定量。金属-有机框架是由有机配体和过渡金属离子通过配位键自组装形成的具有周期性网络结构的晶体多孔材料。Jia等通过逐层自组装法在Fe304表面包被金属-有机框架材料MIL-101(Cr)用于扩大比表面积，并将金属-有机框架应用于人血浆中苯妥英钠的提取。Mohammadi等合成了多种金属-有机框架材料用于提取和纯化生物基质中的丁丙诺啡其中在使用ZIF-67时观察到最高的提取回收率，同时，该法展现出较低检出限(0.
28、080.24gL)和宽线性范围(1.0-100.0gL)xRSD(50gL,n=5)为3.4%0共价有机框架材料是一类通过共价键连接形成的新型多孔结晶有机聚合物，其具有的高比表面积和大孔隙等特点使其成为近年来的研究热点。Jiang等开发了一种基于适配体功能化的磁性共价有机框架材料材料，用于选择性萃取人血清中的痕量羟基化多氯联苯。该法检出限可低至2.1pg/ml,且方法回收率大于90%oChen等合成了一种核壳结构的磁性共价有机框架材料，并将其作为固相萃取剂，提取与富集人血清样品中的5种双酚。四、LC-MS/MS技术应用于TDM的开发策略与挑战在使用LC-MS/MS进行TDM时,一些开发策略有助
29、于帮助我们快速建立方法，同时需要考虑可能面临的一些挑战，如基质效应、代谢物干扰、量值溯源与质量控制，其中代谢物干扰又包括体内异构和源内裂解。这些LC-MS/MS存在的问题可能会对定量的准确性和结果的可信度造成干扰,下面将简要总结方法开发策略以及问题可能产生的原因以及应对措施。（一）方法开发策略在进行方法开发前,需要收集药物相关信息,包括相对分子质量、结构式、在不同溶剂（水、甲醇、乙睛、正己烷、异丙醇）中的溶解度、油水分配系数等。首先需要确定药物在正负离子扫描模式下的母离子和子离子质荷比，并确定定量与定性离子对，优化质谱参数以获得更高响应。在方法开发时需选择至少2个离子对，以排除共沉淀代谢物和内
30、源性物质带来的干扰。其次是选择合适的流动相、梯度与色谱柱。结构式对于分子极性的预测具有重要作用。可根据官能团种类及数量对物质极性做初步判断，预估其在常用C18色谱柱上的保留行为，以便于调整色谱柱的种类（如更换为亲水柱、苯基柱如阿米卡星、氨基糖甘类抗生素，在水中极易溶，几乎不溶于甲醇和丙酮，为极性化合物，因此在定量时使用亲水柱进行分离。同时需对比处理后的空白血浆或血清及分析物色谱图,确保在待测物保留时间内无干扰。最后，所建立方法通过一系列方法确证（如线性、精密度、准确度）后,即可进行临床样本测定。（二）基质效应在基于LC-MS/MS进行生物样本分析时,进入质谱系统的样品经离子源雾化后形成微小液滴
31、，电荷聚集在液滴表面，溶剂挥发后使得目标化合物与样本中的一些共同提取物在形成带电离子过程中产生竞争，导致目标化合物的信号被抑制或增强，这种现象被称为基质效应，其中导致信号降低的离子抑制较为常见。基质效应的产生可归因于样品组分（如蛋白质、磷脂类化合物和采血管抗凝剂）和流动相组分（如添加高浓度缓冲盐Yang等和Matuszewski等提出，减少基质效应的方法主要有：（1）选择适宜的样品前处理方法可最大限度地去除人血液样本中的内源性物质，如采用SPE小柱可有效过滤经沉淀的蛋白质和各类脂质，使采集的谱图基线更干净且易于定量。（2）选择合适的内标。所选择的同位素内标应与目标化合物存在至少3个质量单位的质
32、量差，以避免天然同位素对内标信号产生贡献。与气同位素相比，13C和15N化学性质更为稳定。这是因为宗代内标在离子化过程中会与分析物发生氢-气交换，使得定量结果假性升高。若同位素内标难以获得，应首选与待测物结构相似的化合物。（3）选择更有效的色谱条件，如可选择将内源性脂质先洗脱以降低干扰。（4）稀释待测样本是最直接的降低基质效应的方法，T殳在处理样品前用溶剂进行稀释，但应在进行方法确证时评估稀释效应所带来的影响。（三）代谢物干扰代谢物干扰是影响定量的另一个关键因素。当使用原药进行治疗时，原药经血液中酶的作用迅速转化为母体药物，但有一小部分原药可能保持不变,仍在体内循环。经体内吸收产生的代谢物对目
33、标物的产生信号影响可来自多种途径，如源内裂解外和体内异构化。药物代谢产物存在于患者样本中，其中一些可以通过源内裂解重新转化为母体药物，在未经良好色谱分离的情况下影响母体药物的定量。例如，在抗真菌药物伏立康嗖由CYP2C19介导而产生的氧化产物与艾滋病病毒整合酶抑制剂拉替拉韦的葡萄糖醛酸代谢物的实例中观察到了源内裂解现象。推测其原因可能是：(1)毛细管电压过大，导致目标物在带电过程中结构被破坏；(2)锥孑麻口进样孔之间的去簇电压过大，高分子化合物(如单克隆抗体药物)形成带多电荷的离子碎片，加去簇电压是为了避免离子簇合。若电压过大会打碎目标物，造成源内裂解。因此，在建立质谱方法时，可在多次调谐后选
34、用最优的去簇电压。药物吸收入血后在体内异构化，产生与目标母体药物相对分子质量相同的化合物，二者在色谱系统中共洗脱，且经电离后产生相同质荷比的产物离子，低分辨质谱仪难以区分，因而导致对前药在体内暴露量的严重高估。在进入质谱前可通过调整液相方法实现色谱分离。另一种方法是使用HRMS,该仪器可提供高度精确的质荷比。Furlong等在对大鼠血清样品中的小分子化合物进行LC-MS/MS定量时,在内标的提取离子色谱图中观察到一个干扰峰。通过使用HRMS,他们确定这是一个N-去甲基代谢物的13C同位素，它与结构类似物的内标产生相同的响应强度。HRMS对于未经良好色谱分离或没有特征产物离子的干扰代谢物也具有较
35、强的识别能力。(四)量值溯源与质量控制量值溯源是通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够最终溯源至国家计量基准或国际计量基准，以确保检测结果的可靠性。国际检验医学溯源联合委员会所公布的国际标准物质和参考测量程序是全球公认的金标准。但目前在国内，临床检验中很多化合物都没有可溯源的标准物质，且临床实验室多使用自建方法，仍有临床质谱相关诊断试剂盒未取得医疗器械注册证，溯源性和结果可比性难以保障。当前我国各类药品成分的纯度标准物质缺乏且使用频率较低、基体标物的研制种类仍不够完善，国内临床检验结果的量值溯源体系亟待建立。TDM的质量控制对于确保定量结果的准确性意义重大，有助
36、于及时发现样品测定过程中带来的误差。在我国，TDM室内质量控制评价目前尚无统一标准，且实验室自建方法当前仍无法规支持。根据文献报道，需在检验时注意以下方面：选择稳定且符合样品基质的质控品、适宜的质控浓度和分析频率、LC-MS/MS的额外质量控制样品（包括不含待测物和内标的双空白样品、含内标但不含分析物的空白样品质控品可接受性评价、质控失控的纠正、多组分和多重检测的质控要求、周期性质量保证程序（质谱仪校准、仪器间测定结果相关性等力各临床实验室可依据检测项目和项目运行情况来选择质控规则。最早使用的质控工具是Levey-Jennings质控图和Westgard多质控规则2。世纪90年代后出现了6。质
37、量管理。Zhao等使用6。规则对临床实验室的自建方法进行评估,发现校准偏差是影响准确性的主要因素。五、总结与展望TDM作为优化患者给药方案的关键一环，精准测定待测物的浓度至关重要。与免疫法相比JC-MS/MS在拓宽线性范围、识别结构类似物以及提高定量结果准确度方面具有独特的优势。目前各临床实验室已针对不同检测需求，如日常定量、探明药物代谢通路，建立了免疫抑制剂、抗癫痫药、抗菌药等常见需要TDM的药物定量方法。但LC-MS/MS法发展至今仍面临一些挑战，随着国内各类专家共识与政策性文件发布，临床实验室建立药物浓度参考区间、质量控制体系以及标准化的参考测量程序将是推动1.C-MS/MS法广泛应用的关键。在未来的TDM方案中，基于新型纳米材料的样本前处理方法可降低基质干扰，获批质谱法试剂盒与自动化前处理流程能够提高周转效率，增加检测通量。在结果判读方面，对于不同患者个体间产生疗效差异的现象，药物定量结果与药物基因组学、群体药动学理论相结合将是今后的发展方向。本文引用来源：李姿颖，谢洁，屈子裕，江游，张谛，禹松林，马晓丽，邱玲，戴新华，方向，俞晓平.基于液相色谱-串联质谱技术的治疗药物监测方法研究进展几中华检验医学杂志,2024,47
