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1、高效液相色谱-电化学检测法在检测油脂中高级脂肪酸的应用摘要本文提出了一种利用高效液相色谱-电化学检测方法分离并检测高级脂肪酸的系统。一种结构性柱ODS柱作为固定相,乙醇-乙腈 混合物作为流动相。通过由6mm2-甲基-1,4-萘醌和76mm高氯酸锂组成的混合柱后,乙醇-乙腈的流出液混入了醌。峰高为4的高级脂肪酸量在-415 mV出测得相对于饱和甘汞电极,测得值与脂肪酸数量在20到1200pmol间有线性关系。这种方法可检测到不同油样中的游离脂肪酸,不仅敏感度高、重现性好,也是一种用于分离,测定油脂中游离脂肪酸的简便方法。关键词:电化学检测;脂肪酸1介绍利用气相色谱法GC和高效液相色谱法分离和测定
2、脂肪酸,人们已经有过很多次尝试。在气相色谱分析已经广泛应用的今天,通常是将游离脂肪酸先甲酯化,然后注入到毛细管色谱柱。甲基化水平和气相色谱仪器,如程序升温、注射、毛细柱的类型、载气、探测器,都是影响结果精确度的重要因素。高效液相色谱-荧光探测法测定脂肪酸的主要优点就是灵敏度高。但由于有吸收较弱和荧光性脂肪酸干扰, 在柱分离时应有一种具有较强发色或者荧光基团的衍生物,以保证高效液相色谱检测的高灵敏度。为此已经有许多种这样的脂肪酸衍生物开发出来了。这种脂肪酸衍生物在某些情况下,由于羧基基团活性较差,需要催化剂才能完成反应。由于这种脂肪酸衍生物和催化剂的特殊性,试剂用量、反应温度和反应时间对于较高反
3、应活性至关重要,避免产生较多的副产品。通常水是一个与脂肪酸衍生物不相容的环境。为了解决这个问题,需要对亲水性胶改善衍生物与水的相容性效果进行检验。虽然荧光检测敏感度高,但荧光强度变化受复杂样品中荧光物质杂质的影响,除非在实验之前有相应的除杂步骤。因此设计一种不需要除杂的简便快速的分离检验方法十分有必要。作者开发了一种测定油脂中游离脂肪酸含量的新方法,基于质子化醌的还原量：含有2-甲基-1,4-萘醌 的脂肪酸乙醇溶液产生的伏安图还原峰比VK3自身的还原电位更明显,峰的高度与脂肪酸浓度成正比。该方法应用于流动注射分析的电化学检测法ECD法,使各种脂肪和油样中游离脂肪酸的测定更加简便快捷。因为脂肪酸
4、含量可以由测量流动信号峰高和面积得出,该方法也适用于液相色谱-电化学检测法测定脂肪酸含量。高效液相色谱-电化学检测法被认定为一种不用衍生物检测高级脂肪酸的简便方法。2实验2.1试剂棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸,均购自和光试剂公司 。标准酸溶液都用乙醇-乙腈混合溶液溶解。以下油样都是从市场上购得：山茶油、玉米油和油菜籽油、橄榄油,大豆油。乙醇-乙腈混合溶液和一个装有6mm维生素K3+ 76mm高氯酸锂的柱子分别作为流动相和醌溶液。电解液中的高氯酸锂可以减少电化学电池的电阻。图1 高效液相系统：流动相是乙醇-乙腈混合溶剂,醌溶液为6mm维生素K+76mm高氯酸锂的乙醇-乙腈溶液,DG是除气装置,P
5、1、P2是泵,S是样品注射器20l,分离柱色谱柱100 RP-18,250 mm*4mm,5微米；MC是混合柱线圈50厘米,D是电化学检测器、电化学电池和电位仪,R是记录仪。2.2 仪器高效液相色谱-电化学检测系统如图1所示,包括除气器 、泵P1和P2、样品注射器、结构性柱ODS柱、电化学电池,电位仪、记录仪。电化学电池由玻碳工作电极、饱和甘汞电极 、参比电极和不锈钢辅助电极组成。流管由蒙着铝箔避光的不锈钢导管和聚四氟乙烯导管组成。2.3 实验步骤为了注射进分离柱,准备的样品溶液应与适当的乙醇-乙腈混合物混合均匀。如果油样没有被乙醇-乙腈 混合物充分溶解,混合液将离心分层,上清液被误认作为样本
6、溶液。环境温度保持在室温,将20ml的小分样品和标准酸溶液被注入结构性ODS柱。脱氧下的流动相和醌溶液在1.1ml/min流量下由P1和P2流入。检测游离脂肪酸的电压维持在-415mV。样品溶液中每种脂肪酸含量可以根据信号峰高测得。3. 结果与讨论3.1VK3中脂肪酸的存在导致伏安降低电极表面的醌质子化反应在其电子转移之前出现。质子化的醌在某一电势下的伏安图上呈现新峰的可能性比醌大。高级脂肪酸,如在含有VK3和高氯酸锂的酒精溶液中的棕榈酸,以前被人为在质子化的VK3的伏安图上还原峰比VK3本身导致的还原峰更明显；VK3本身在-720mV相对于饱和甘汞电极处给出明显的还原峰,并且溶液中加入棕榈酸
7、后质子化的VK3在-320mV处记录了新的峰。此峰的高度与加入脂肪酸的量成正比。质子化的VK3伏安峰半个峰高伴随着加入的脂肪酸pKa增大而负电位明显增大。然而,不同的高级脂肪酸半个峰高的电位在本质上是一样的,因为脂肪酸的增强度相差不大。每种脂肪酸可以在那个电位下被检测到,这将共同减少质子化醌电流。质子化醌的电位减少比溶解氧产生的电位减少要小。第一个含有38mm高氯酸锂的乙醇溶解氧的减少峰半峰为-730 mV相对于饱和甘汞电极。然而,可能有溶解氧引起的背景电流,因为氧减少的电位比-300 mV相对于饱和甘汞电极更低。保留时间/min乙腈%乙醇%乙腈%乙醇%峰高/nA保留时间图2 A、B两图分别为
8、保留时间和峰高与流动相溶剂比的关系。a、b、c、d分别为亚油酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸,脂肪酸的量均为200pmol。高效液相色谱条件：醌溶液,6mmVK3+176mm高氯酸锂在乙醇-乙腈的混合溶剂中,采样体积20ml,分离柱为色谱柱100 RP-18250 mm*4mm,5微米,柱温为室温,流量为1.1ml/min,采用的电位差为-415mV相对于饱和甘汞电极。3.2高效液相色谱-电化学法考虑到以上因素,高效液相色谱-电化学法检测脂肪酸产生了。用一个结构性ODS和乙醇-乙腈混合溶液作为流动相完成高级脂肪酸的反相分离。混合溶液和醌溶液中的溶解氧由排气装置除去。20ml含有脂肪酸的小份溶液注射到O
9、DS柱中；流出液混入了醌溶液,脂肪酸被电化学检测器检测到。混合溶液中乙醇-乙腈的比例对脂肪酸分离和检测灵敏度的影响已作出探究。图2中,200 pmol的棕榈酸、油酸、亚油酸和硬脂酸下,保留时间和峰高的信号分别与两种溶剂比例的关系如曲线所示。乙腈含量的比例越大,脂肪酸峰分离越明显。乙腈含量90%时,检测的所有脂肪酸峰值达到最大。乙醇-乙腈含量比为10:90被定作是最适合的流动相。图3为200pmol棕榈酸、油酸、亚油酸和硬脂酸在目前的实验条件下的流体伏安图。在此基础上,脂肪酸的电位检测条件被确定为-415 mV 相对于饱和甘汞电极。图4A是一个典型的标准棕榈酸、油酸、亚油酸和硬脂酸混合样的色谱图
10、。这些脂肪酸在15min已很好的分离。峰高与注入的脂肪酸量在20-1200pmol围呈线性关系表1。200pmol的棕榈酸、油酸、亚油酸和硬脂酸检测十次的相对标准差R.S.D.分别为1.3 %,1.2 %,0.96 %和0.79 %。各脂肪酸的检测限信噪比=2为20 pmol。电位值/伏特相对于饱和甘汞电极峰高/nA图3是脂肪酸标准样的流体伏安图。a、b、c、d分别是亚油酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸。脂肪酸的量均为200pmol。高效液相色谱条件：流动相为乙醇-乙腈10:90混合溶剂,醌溶液,6mmVK3+176mm高氯酸锂在乙醇-乙腈10:90的混合溶剂中,其他条件同图2所述。时间/min峰高图
11、4是典型的色谱图：A是包含a亚油酸、b油酸、c棕榈酸、d硬脂酸各200pmol的标准脂肪酸混合溶液色谱图,B是玉米油的色谱图。色谱条件为：所用电位是-415mV相对于饱和甘汞电极,其他条件同图3所述。表1标准液中高级脂肪酸的线性回归分析相关系数r含量范围pmol棕榈酸硬脂酸油酸亚油酸回归线化合物3.3油脂中高级脂肪酸的检测橄榄油、山茶油、玉米油、菜籽油和豆油实际样品的分析是为了评价这种方法的有效性。简单的脂肪酸溶液注入后色谱图很容易获得。图4B是一个典型的玉米油色谱图。各游离脂肪酸的峰高度比为：棕榈酸:硬脂酸:油酸:亚油酸=5:1:13:25,这和文献中玉米油脂肪酸组成比是相同的。测得的油脂中
12、游离高级脂肪酸数据在表2中列出。相对标准差从0.8%到2.8%。表2 植物油中脂肪酸含量和添加的脂肪酸标准物回收率分析回收率%棕榈酸硬脂酸油酸亚油酸添加浓度mol/g测得平均值mol/g回收率n=5相对标准差%含量n=5油 脂肪酸油菜籽油山茶油大豆油玉米油橄榄油表3 高效液相色谱-电化学检测法与荧光检测法a测定游离脂肪酸的比较分析方法荧光检测法校准曲线线性范围分析时间山茶油中的游离脂肪酸电化学检测法a高效液相色谱-荧光法使用亚当试剂作为荧光试剂。b需要的时间包括准备时间和高效液相色谱检测时间。回收率分析,向每一个油样橄榄油、山茶油、玉米油、油菜籽油和大豆油中加入标准的高级脂肪酸混合物,然后用这
13、种方法分析检测。如表2所示,得到理想的脂肪酸回收率数据。高效液相色谱-荧光法HPLC-FL对照检测的数据表明,这种高效液相色谱-电化学检测法使得快速、简便地检测油脂中高级脂肪酸成为可能。使用部标准时荧光检测法的相对标准差小于5%,而这种电化学检测法检测油样时相对标准偏差小于3%如表3所示。重现性良好的原因是预处理简单,没有使用脂肪酸衍生物。当油样中含有高度非极性组分时,这种成分不溶于乙醇-乙腈10:90混合溶剂,因而注入色谱柱的只是油样-乙醇-乙腈的混合物。使用当前方法,高度非极性成分几乎没有接触工作电极和结构性ODS色谱柱。每天使用高效液相色谱-电化学检测法检测十多个样品,三个月后玻碳工作电极表面依然保持稳定。使用负电位监测脂肪酸是为了不引起碳表面氧化,洗脱液溶剂可以预防有机污染物的粘附在电极表面产生疏水性。这些因素还会导致更大的重现性。使用高效液相色谱-荧光法检测限低至20 毫摩尔是可能的。使用本文方法检测限最低可达20pmol。原因是预处理简单,没有使用标签代理的脂肪酸衍生物,样品用量小而且检测时间缩短了。样品液只有直接注入高效液相色谱系统才会被检测到。本方法是一种相当有效的测定高级脂肪酸的方法。致这项工作是在得到日本教育、科学、文化部门的部分科研资助拨款援助下完成的。8 / 9
