【发酵工程】余龙江版第11章 发酵产物的分离纯化ppt课件.ppt

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1、第11章 发酵产物的提取与精制,发酵产物的提取与精制属于发酵工程的下游加工技术。下游加工亦称发酵后处理，是指从发酵液或酶反应中分离纯化目的产物并加工成成品的过程。在多数情况下是从稀的发酵液中回收目的产物，整个过程有多项单元操作组成，其中有许多是经典的化工单元操作。,11.1 下游加工过程概述,一、下游加工过程的重要性,1. 获得商业产品的关键环节。,2. 促进发酵工程上游加工技术 或工艺的改进。,3. 拥有市场竞争力的重要保证。,二、下游加工过程的特点,2. 发酵产品在培养液中具有浓度低，稳定性差，对酸碱等外界环境十分敏感，容易失活。3. 下游加工过程代价昂贵，产品回收率不是很高。4. 发酵过

2、程复杂，要求下游加工工艺应具有相当的适应性，以确保最终产品的纯度和质量。,1. 发酵液是复杂的多相系统，属非牛顿液体，从中分离所需产品困难大。,三、下游加工的原则和要求,原则： 1）短时间内处理 2）分离时尽量低温 3）选择生物物质稳定的pH 4）要程序化进行清洗，消毒，包括厂房，设备，管路要求： 1）达到所需的纯度 2）成本要低，得率高 3）工艺过程要简便，对分离物质特性清楚 4）废弃物要易处理，能够做到综合利用（零排放；清洁生产） 5）实验室产品能够放大生产,四、下游加工工程的一般流程,1. 粗分离阶段（1）发酵液的预处理和固-液分离。（2）产物的初分离。2.纯化精制阶段（3）1产物的高度

3、纯化。（4）成品加工。,预处理,破碎细胞,碎片分离,细胞分离,精制,成品加工,F发酵液,提取,加热 沉降 均化 离心分离 沉淀 层析 无菌过滤 调pH 离心分离 研磨 萃取 吸附 离子交换 浓缩 絮凝 过滤 溶胞 超滤 萃取 亲和 超滤 膜分离 双水相萃取 超滤 憎水 冷冻干燥 吸附 喷雾干燥 电泳 结晶,发酵液,胞外产物,操作步骤减至最少，并尽可能提高各步骤的收率,一、发酵液的一般特征 1. 含水量高，一般可达9099%，处理体积大。 2. 产品浓度低。 3. 悬浮物颗粒小，密度与液体相差不大。 4. 固体粒子可压缩性大，一压缩就变形。 5. 液体黏度大，大多为非牛顿型流体。易吸附在滤布上。

4、 6. 产物性质不稳定，不耐热、等会酸碱敏感、易被氧化、易被微生物污染及酶分解。,11.2 发酵液的预处理与固-液分离,二、发酵液预处理的目的和要求1.预处理的目的 （1）改变发酵液的物理性质，促进悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率 （2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数是液体） （3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。,2.发酵液预处理的要求: （1）菌体的分离 （2）固体悬浮物的去除 （3）蛋白质的去除 （4）重金属离子的去除 （5）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除 （6）改变发酵液的性质 （7）调节适宜pH值和温度,三、发酵液预处理的方法,1. 降低液

5、体的黏度2. 絮凝法3. 重力法4. 等电点法5. 加入助滤剂6. 缴入反应剂,1 降低液体黏度,（1） 加水稀释法 采用加水稀释法虽然能降低液体黏度，但是会增加发酵液的体积，因此加大后续过程的处理量。 而且稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才算真正有效，即若加水一倍，则稀释后液体的黏度必须下降50%以上，才能有效提高过滤效率。,（2）加热法,升高温度可以降低悬浮液的黏度，除去某些杂蛋白，降低悬浮物的最终体积，破坏凝胶状结构、增加滤饼的空隙度，提高过滤效率。 不适用热敏性的物质，而且要防止加热导致细胞溶解，胞内物质外溢。,（3）添加酶制剂,比如：加酶将多糖转化为单糖,凝聚是在高价无机盐作

6、用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。 絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。,凝聚和絮凝的概念,扩散双电层的结构模型图胶粒能保持分散状态的原因,2. 凝聚和絮凝法,凝聚技术,扩散双电层的结构模型图,凝聚原理：电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，使范德华力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子。,胶粒能保持分散状态的原因主要是带有相同电荷和扩散双电层的结构，一旦由于布朗运动使粒子间距离缩小到它们的扩散层部分重叠时，即产生使两个粒子分开：从而阻止了粒子的聚集。电位越大，电

7、排斥作用就越强，胶粒的分散程度也越大， 此外，由于胶粒表面的水化作用，形成了包围于粒子周围的水化层，也能阻碍胶粒间的直接聚集。 但是，水化膜主要是伴随胶粒带电而引起的，一旦电位降低或消除，水化层也会随之减弱或消失。,常用的凝聚剂Al2(SO4)3.18H2O，AlCl3.6H2O，FeCl3，ZnSO4，MgCl2阳离子对负电荷的胶粒凝聚能力次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+,常用的凝聚方法：在稀溶液中加入电解质以促进凝聚。试剂包括酸、碱、简单电解质和合成的高分子电解质。,絮凝原理：在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。,絮凝剂

8、通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架连接时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。,絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如-COOH）或阳离子（如-NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。,常用的絮凝剂：明胶、甲基纤维素、多聚丙烯酸、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠,+,- -,影响絮凝的因素,絮凝剂的添加量发酵液的pH絮凝剂的分子量搅拌转速搅拌时间,混凝有时候絮凝剂是高分子非离子型和阴离子型的，主要通过分子间引

9、力或氢键作用产生吸附架桥，因此通常与无机凝聚电解质搭配使用。首先加入电解质，使悬浮粒子间的双电子层电位降低、脱稳，凝聚成微粒，然后再加入絮凝剂凝聚成较大的颗粒。,3. 重力法,在工业上用的较多的主要是离心和过滤. 过滤常用板框真空吸滤或电动筛等，离心和过滤能否顺利进行取决于很多因素。,一般温度高，压力大，发酵液粘度小，滤布选用适当，助溶剂适宜，搅拌都可以提高过滤速度。,4、等电点法,蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。胶体粒子的稳定性和其所带电荷有关。蛋白质在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。因此可利用此特性分离或去除良性物质。因为羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性质通常强于

10、碱性，因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH 4.05.5）。,5、添加助滤剂： 一般为惰性助滤剂：是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质 作用：助滤剂表面具有吸附胶体的能力，并且由此助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子型结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，可以保持良好的渗透性 使用方法（1）：在滤布上预涂，作为过滤介质使用 （2）：按一定比例混入待滤的悬浮液中 常用的助滤剂：硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的碳、炉渣、重质碳酸钙,6、添加反应剂： 添加可溶解的盐类，生成不溶解的沉淀； 生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构； 沉淀本身可作为助滤剂，还能使胶状物和悬浮物凝固。

11、,四、发酵液的相对纯化,1.高价无机离子的去除（Ca2+、Mg2+、Fe2+等）2.可溶性杂蛋白的去除,高价无机离子的存在，会影响树脂对生化物质的交换容量。杂蛋白质的存在，不仅在采用离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时会降低其吸附能力，而且在采用有机溶剂或两水相萃取时，容易产生乳化，使两相分离不清，在预处理时，应尽量除去这些物质。,1 高价无机离子的去除,发酵液中杂质很多，其中对提炼影响最大的是高价无机离子（Ca2、Mg2、Fe2）等。,去除钙离子：通常使用草酸。但由于草酸溶解度较小，不适合用量较大的场合，可用其可溶性盐，草酸价格昂贵，注意回收。去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。用

12、磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如：环丝氨酸的提取。去除铁离子：可加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。,2. 杂蛋白质的除去（1）沉淀法 加热变性 蛋白质从有规则排列变为不规则结构的过程称为变性。使蛋白质变性的方法有：加热，调节pH，加酒精等有机溶剂或表面活性剂等 。 在链霉素生产中，在pH3.0时，加热至7075，维持30min，黏度降为1/6，过滤速度提高3倍。,变性法的局限性：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH也会导致某些目的产物失活，并且要消耗大量酸碱；而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。, 加有机溶剂、表面活性剂、酸碱等 在酸性溶液中，蛋

13、白质能与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀； 在碱性溶液中，蛋白质能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。,（2）吸附法 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 例如：在枯草芽孢杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而可加快过滤速率。,11.3 固-液分离过程及设备简介,意义：固-液分离过程下游加工的重要环节，用于发酵液的预处理和生物产品的纯化、精制等环节。,方法：常用的方法有过滤、离心。此外还有膜分离、双水相萃取和扩张床吸附等方法。,

14、影响发酵液固-液分离的主要因素：菌体的大小、形状及发酵液的黏度，还有发酵液的温度、pH值、加热时间等。,目的：收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，或者是收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物，如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等。,1. 过滤,定义：用过滤介质将悬液中的固形颗粒与液体分离的过程。,常用的过滤方式：加压过滤和真空过滤,典型设备主要有：板框压滤机和鼓式真空过滤机,（1）板框过滤机,板框压滤机由压滤机滤板、液压系统、压滤机框、滤板传输系统和电气系统等五大部分组成。,真空转鼓过滤机,优点： 真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、处理量大。特别适合固体含量大（

15、10）的悬浮液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。缺点： 由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干度不如加压过滤。,2、离心,定义： 基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。,离心分离方法,(1)差速离心工业上最常用的离心分离方法,定义：在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。对象：混合样品中各沉降系数差别较大的组分。,速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀,原理：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质

16、的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。分类：1）移动区带离心 2）等密度离心常用密度梯度物质：蔗糖、甘油、CsCl、NaBr,(2)密度梯度离心多用于生化研究,1）移动区带离心,含几个组分的样品在足够高的离心场中离心时，每种颗粒都达到其最大沉降速度，这时样品开始分离。离心管的上层逐渐形成透明的上清液，并形成对应于样品各组分的一系列浓度界面，界面的移动相对于每种组分来说是特征的。 用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。此法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。,2）等密度离心,细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和够长时间则沉降或漂浮到与自身

17、密度相等的介质处，并停留在该层达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。,离心机分类,制备性离心机,分析性离心机：超速离心机,普通离心机,高速冷冻离心机,超速离心机,实验型离心机,工业型离心机,碟片式离心机是传统离心机，为目前工业上应用最广泛的离心机。分离因数可达1000-20000，最大处理量达到300m3/h，常用于大规模的分离过程。适用范围 细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片。,管式离心机管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设备，其转鼓细长，可在15000-50000的高转速下工作，分离因数可达104-6105。它设备简单、操作稳定。适用范围细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等。

18、,影响固液分离的因素,微生物种类真菌的菌体大，固液分离容易，可采用真空转鼓式过滤或板框过滤；细菌和细胞碎片小，固液分离较难，固液分离前要进行预处理。发酵液黏度固液分离速度与黏度成反比。其它因素培养基组成、发酵周期、发酵液的pH值、温度和加热时间等,离心分离 （1）优点： 分离速度快，效率高， 操作时卫生条件好等优点， 适合于大规模的分离过程。 （2）缺点： 投资费用高， 能耗较大。,3. 其他固-液分离方法,（1）膜分离：利用不同组分通过膜的传递速度不同而得以 分离的方法,（2）双水相萃取：利用不同组分在双水相分配系数不同进 行分离方法。,（3）扩张床吸附：将固-液分离合目的产物吸附合并成一步

19、 进行的一种分离方法。,11.4 微生物细胞的破碎,微生物的代谢产物如果是胞内物质（如有些酶制剂、干扰素、胰岛素等），那么首先要收集菌体，进行细胞破碎。,1. 微生物细胞壁的组成与结构：（1）细菌细胞壁：（2）酵母菌细胞壁比G+菌稍厚，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质等。（3）其他真菌细胞壁主要由多糖组成，如几丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。,2. 常用的细胞破碎方法,细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的方式可分为机械法和非机械法两大类。亦可按所用方法的属性分为物理法、化学法和生物法三类。物理破碎法：高压匀浆法、挤压法、高速珠磨法、超声波法；化学破碎法：渗透冲击法、增溶法。生物破碎法：酶溶

20、法,细胞破碎机理图,（1）物理破碎法, 高压匀浆法 大规模细胞破碎的常用方法,原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。,适用范围：适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。特点：在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。,大、中、小型高压匀浆器, 挤压法（X-press法）,将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25至-30形成冰晶体，利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出使之破碎。,原理：细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。主要用于实验室中。,优点：适用

21、的范围广、破碎率高、细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高。缺点：对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。, 高速珠磨法,原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。,优点：可连续操作,缺点：破碎中产生的热量，需采用冷却措施。,胶体磨,德国进口珠磨机, 超声波破碎法,超声波破碎也是应用较多的一种破碎方法。通常采用的超声波破碎机在15-25千赫（kHz）的频率下操作。,原理：在超声波作用下液体发生空化作用，空化泡的急剧膨胀压缩和内向爆破产生冲击弹性波，将声能转化为机械能，形成

22、粘性消散涡流，如果液体旋涡小于细胞尺寸，产生不同密度移动，当细胞的动能超过细胞壁强度时，至使细胞破碎。,特点：杆菌比球菌易破碎，革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌易破碎，酵母茵效果较差。菌体浓度太高或介质黏度高，均不利于超声波破碎。,最大问题是在超声过程中声波被溶液吸收产生大量热量，不能及时将热量移出，细胞悬浮液的温度急剧升高，导致酶和其它生物活性物质变性失活。因此，在实验室中往往采取间断破碎的方法，即经短时间破碎，冷却降温，再进行破碎，经多次反复达到破碎目的。 因此在细胞破碎过程中，有效冷却是关键。 也因大容量容器的声波传递和散热困难，限制了超声破碎的大规模应用。,球蘑机的粉碎球和机器,匀浆机,

23、组织粉碎机,（2）化学破碎法,定义：利用化学试剂改变细胞壁或膜的结构或完全破除细胞壁形成原生质体后，在渗透压作用下使从而使细胞膜破裂而释放胞内物质的方法。,优点：对产物的释出选择性好，细胞外形较完整、碎片少、核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，故使用较多。缺点：容易引起活性物质失活破坏；化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。,特点：较温和的一种破碎方法，操作也简单。应用：仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。, 渗透压冲击,原理：将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，转入到渗透压低的缓

24、冲液或纯水中，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。,如：将收集到的细胞用适当的缓冲液或生理盐水洗涤，除去细胞沾染的培养基或其它杂质，将其悬浮在含10-30%蔗糖的适当缓冲液中，为了防止目的酶或蛋白质失活，若目的酶或蛋白质需要金属离子时，在缓冲液中加入金属离子；若金属离子会使目的酶或蛋白质失活，在缓冲液中需加入金属离子螯合剂，如EDTA等。在低温下，使细胞悬浮液混合均匀，放置使细胞内外渗透压达到平衡。在低温下离心，收集细胞；在激烈的搅拌下将细胞快速加到较大体积的低浓度的缓冲液中，由于细胞外渗透压突然降低，使细胞破碎。,应用,用此法

25、处理大肠杆菌，可使磷酸酯酶、核糖核酸酶I以及脱氧核糖核酸酶等释放到溶液中。释放的蛋白质的量一般仅占细胞蛋白质的4-7%。因此，后序的蛋白质分离纯化比较简单。此法对细胞壁外有着牢固的糖蛋白包裹层，使胞内渗透压不受严重影响的格兰氏阳性菌不适用。在高渗透压环境下生长的细菌, 如海洋细菌，嗜盐细菌，更适合该法。如可有效的将海洋发光细菌的细菌荧光素酶释放，酶释放率可达到80-90%。,原理：利用某些化学试剂如有表面活性剂等，增加细胞壁或膜的通透性，而使细胞破碎的方法。, 增溶法:,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,常用的表面活性剂有SDS、EDTA、Triton X-100，有机溶剂有

26、甲苯、乙醇、异丙醇、盐酸胍和尿素。,Triton X-100牛黄胆酸钠十二烷基磺酸钠,A 表面活性剂,表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,主要是处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,B EDTA螯合剂,能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。乙醇、异丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。,C 有机溶剂,与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。盐酸胍和脲是常用的变性剂。

27、,通用性差；时间长，效率低；有些化学试剂有毒 。,化学渗透法优点：,缺点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,* 表适用,（3）生物破碎法,常用的生物破碎法主要是酶溶法。利用生物酶分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。,酶溶法的优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。,常用的溶酶,溶菌酶-1, 3-葡聚糖酶-1, 6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽键

28、内切酶壳多糖酶等,溶菌酶主要用于细菌类,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的-1, 4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。,利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,酶溶法的优点： 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,酶溶法的缺点： 溶酶价格高，溶酶法通用性差，产物抑制的存在。,（2）自溶作用,定义：是一种特殊的酶溶方法，所需溶

29、胞的酶是由微生物本身产生的，而不需要外加其它的酶。,影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。,应用：在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次。,(3) 反复冻结-融化法,此法使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30的气流中吹干；真空干燥多用于细菌

30、。,(4)干燥法,2. 破碎率的测定,测定细胞破碎率的常用方法： 直接计数法 测定释放的蛋白质含量或酶活量 测定导电率,4.破碎技术的研究方向,多种破碎方法相结合与上游过程相结合与下游工程相结合,11. 5 浓缩技术,浓缩过程是发酵工业提取与精制过程常用的单元操作。浓缩的目的是将低溶质浓度的溶液通过除去溶质变为高溶质浓度的溶液。它广泛用于有机酸、氨基酸、核苷酸、酶制剂及抗生素等发酵工业产品的提取分离过程。常用的浓缩技术有蒸发浓缩法、冷冻干燥法、吸收浓缩法。,（1）蒸发浓缩法,蒸发浓缩法概念及原理,蒸发是工业发酵生产过程中常用的发酵产品浓缩方法之一。蒸发的目的是使溶液中的溶剂在一定的温度和压力下

31、加热后汽化除去，从而提高溶液中溶质的浓度。这里所指的溶液是由不挥发的溶质与液体溶剂所组成，蒸发过程只有溶剂汽化而溶质不汽化。,蒸发浓缩装置的设计,蒸发是溶液表面的溶剂分子获得的动能超过了溶液内溶剂分子间的吸引力脱离液面进入空间的过程。蒸发快慢与温度、蒸发面积及液面蒸汽分子密度等因素有关。因此，蒸发浓缩装置常按照加热、扩大液体表面积、减压、和加速空气流动等因素而设计,蒸发浓缩装置的分类,常用的蒸发浓缩过程可分为常压蒸发浓缩和真空减压蒸发浓缩过程。按照结构型式不同，常压蒸发设备有中央循环管式蒸发器、横管式蒸发器、夹套式蒸发器、夹套带搅拌外循环蒸发器、强制循环蒸发器等.真空减压蒸发设备根据二次蒸气的

32、利用的情况，可分为单效蒸发和多效蒸发。,分子蒸馏,分子蒸馏克服了传统蒸馏操作温度高，受热时间长等缺点，可解决大量传统蒸馏无法解决的工业化难题，尤其适用于目标产物与杂质之间沸点相差较大的物质的分离。 分子蒸馏的原理是根据分子运动理论，液体混合物的分子受热后运动会加剧，当接受到足够能量后，就会从液体溢出而成为气相分子。,2、冷冻浓缩法,冷冻浓缩法：是工业发酵中生物大分子和具有生理活性的发酵产品浓缩常用的一种有效方法。,冷冻浓缩法原理：在冷冻时水分结成冰，盐类及发酵产品不进入冰内而留在冰外，浓缩时先将待浓缩的溶液冷冻使之变成固态，然后缓慢的融解，利用溶剂与溶质熔点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如

33、酶制剂和蛋白质。,3 吸收浓缩法,吸收浓缩法：是一种通过吸收剂直接吸收出去溶液中溶剂分子使溶液浓缩的方法。,应用吸收浓缩法时要求吸收剂不与溶液起化学反应，而且对大分子类的发酵产品不起吸收作用，易于溶液分开，吸收剂除去溶剂后能重复使用。,11.6 沉淀技术,定义：通过改变条件或加入某种试剂，使发酵产物离开溶液，生成不溶性颗粒而沉降析出的过程。,作用：浓缩作用大于纯化作用，是初步分离的一种手段。,优点：沉淀法具有设备简单、成本低、原料易得、收率高、浓缩倍数高和操作简单等优点。,缺点：于过滤困难、产品质量较低、需要重新精制。,1. 盐析,原理：高浓度中性盐存在下，使生物分子在水溶液中溶解的溶解度降低

34、而产生沉淀的方法，多用于蛋白质（酶）的分离。,常用的盐类是硫酸铵。,优点： 成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。,（1）盐析机制,盐溶：盐低时，S（蛋白质的溶解度）随盐增加而增加；盐析：盐高时，S（蛋白质的溶解度）随盐增加而降低；,（2）溶解度与盐浓度的关系可用下式表示： log S=KSI S：蛋白质的溶解度； I：离子强度； ：常数，与蛋白质种类有关，与盐的种类无关； KS ：盐析常数，与盐种类有关，与温度和pH无关；,盐的种类：影响KS，KS越大，效果越好 溶质的起始浓度 盐析剂用量温度和pH：影响值而影响S。尤其是影响相对溶解度杂质,（3）

35、影响盐析的因素,2. 等电点沉淀,原理：利用两性电解质在在低离子强度下，调节至等电点，可使各种两性电解质所带净电荷为零，能大大降低其溶解度，形成沉淀。,不同的两性电解质具有不同的等电点，从而将其分离开。,优点：操作简单，试剂消耗少，引入杂质少。,缺点: 不能完全沉淀析出，常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。,应用：主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。,等电点操作时要注意： 溶液中离子的种类和浓度对生物分子等电点的影响。 等电点附近的盐溶作用 目的产物的不稳定性。,等电点锌盐法,3. 有机溶剂沉淀,定义：于水互溶的有机溶剂（乙醇、丙酮

36、等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。多用于生物小分子、多糖、核酸和蛋白质等产品的提取。,机理：降低溶液的介电常数，因为分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比，加入有机溶剂，蛋白质分子间的引力增加，溶解度降低。,常用有机溶剂：乙醇、甲醇、丙酮等。,缺点：容易引起蛋白质变性失活，并且有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。,优点：分辨能力比盐析法高，一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀；沉淀不需脱盐；有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，容易进行固液分离；有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留，适用于食品、药品的制备。,4. 非离子型多聚物沉淀,定义：水溶性的非离子多聚物如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖右

37、旋糖酐硫酸钠等，可用于沉淀分离蛋白质（尤其是不稳定的蛋白质）、DNA和RNA等。,机制：多聚物与有机溶剂相似，能降低水化度使蛋白质沉淀；与大分子形成复合物，发生共沉淀作用等,应用最多的是PEG。,优点：其操作条件温和，不易引起生物大分子的变性，沉淀效能高，很少量的沉淀剂就可以使相当多的生物大分子沉淀，且沉淀后的多聚物也容易除去，无毒、不可燃，对大多数蛋白质有保护作用。,应用：广泛用于蛋白质、核酸、细菌和病毒等的分离纯化。,11.7 萃取分离技术,定义：利用不同物质在选定溶剂中具有不同的溶解度的原理来进行不同物质的分离纯化。,优点：选择性好，分离效果好； 对热敏性物质破坏小，且耗能低； 生产能力

38、大，周期短； 便于连续操作，容易实现自动化控制等。,应用：适用于抗生素等小分子物质的分离纯化,定义：是利用萃取目标物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，使其从一种溶剂转入另一种溶剂从而实现分离。,1. 溶剂萃取,在溶剂萃取中，被提取的溶液称为料液，从料液中提取出来的物质称为溶质，用来进行萃取的溶剂称为萃取剂，溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液为萃取液，被萃取出溶质的料液称为萃余液。,（1）生产中萃取操作一般应包括下面三个过程 混合料液和萃取剂密切接触； 分离萃取相与萃余相分离； 溶剂回收萃取剂从萃取相(有时也需从萃余相)中除去，并加以回收。,萃取操作流程分为单级萃取和多级萃取，多级萃取又分

39、为多级错流萃取和多级逆流萃取。,（2）溶剂的选择,萃取用的有机溶剂应对产物有较大的溶解度和良好的选择性。遵循一个简单的规律：“相似物容易溶解在相似物中”，即分子的极性。极性液体互相混和并溶解盐类和极性固体，而非极性化合物溶剂是低极性或没有极性的液体。,选择溶剂时还应注意： 与料液的互溶度应尽可能小； 毒性低； 化学稳定性高，腐蚀性低，挥发性小； 价格便宜，来源方便，便于回收。,工业上常用的溶剂：乙酸乙酯、乙酸戊酯和丁酯等。,（3）水相条件的影响, pH值：直接影响表观分配系数。另外对选择性有影响。 温度：温度会影响生化物质的稳定性，所以一般在室温或低温下进行。同时影响分配系数K和萃取的速度。

40、盐析：硫酸铵、氯化钠等可降低产物在水中的溶解度，还能减小有机溶剂在水相中的溶解度。 带溶剂：能和产物形成复合物，使产物更易溶于有机溶剂相中，提高分配系数。,（4）乳化和去乳化,定义：乳化是一种液体(分散相)分散在另一种不相混溶的液体(连续相)中的现象。,害处：乳化产生后会使有机溶剂相和水相分层困难，产生乳化后使有机相和水相分层困难，,原因：是发酵液中存在的蛋白质和固体颗粒等物质，这些物质具有表面活剂性的作用，使有机溶剂和水的表面张力降低，水易于以微小液滴的形式分散于油相称为油包水型W/O乳浊液；相反，为O/W型乳浊液。, 乳化,方法： a. 过滤或离心分离破乳法； b. 化学法：加电解质中和离

41、子型乳油液的电荷； c. 物理法：加热、稀释、吸附等； d. 顶替法：加入表面活性更大，但因其碳链较短难以形成坚固的保护膜的物质，取代界面上的乳化剂； e. 转型法：如在O/W中加入亲油性乳化刑，使乳化液有生成W/O的倾向，但又不稳定，从而达到破乳目的。最好的方法是防止乳化，如蛋白质是乳化起因，就应设法去除蛋白质。,去乳化：破坏乳浊液,（5）萃取的方式,根据混合- 分离的操作方式，可以分为单级萃取和多级萃取。,单级萃取：只使用一个混合器和一个分离器的萃取。 特点：流程最简单，单收率不高。,多级错流萃取：每级都加入新鲜萃取溶剂，溶剂消耗多，萃取液产物平均浓度较稀，但萃取较完全。,多级错流萃取（F

42、料液；S溶剂；L萃取液；R萃余液）,多级逆流萃取：料液走向与萃取走向相反，萃取剂只在最后一级加入，萃取剂消耗少，萃取液产物平均浓度高，产物收率最高。,多级逆流萃取 （F料液；S溶剂；L萃取液；R萃余液）,2. 双水相萃取法,定义：利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。,（1）双水相形成,大多数亲水性聚合物水溶液与第二种亲水性聚合物混合，达到一定浓度时，会产生两相，两种高聚物分别溶于互不相溶的两相中。,高聚物之间的不相溶性，使得它们无法相互渗透，不能形成均一相，从而具有相分离的倾向，在一定条件下，即能分为两相。,聚合物与盐类溶液也能形成两相。,（2）影响双水相分配的因素,

43、成相聚合物的相对分子质量 成相聚合物的浓度 盐的种类和浓度 pH 温度,（3）双水相萃取的应用,可用于分离和纯化酶、核酸、生长素、病毒、干扰素等。,常用的双水相系统为聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/无机盐，后者中聚乙二醇/硫酸盐或磷酸盐系统最为常用。,目的分子与杂质（如细胞等）应分配在不同的相。分配系数应足够大。容易离心分离。,（4）两水相分离条件,3. 反胶团萃取,定义：利用表面活性剂在有机溶剂中自发形成的内含亲水微环境的反胶团，使生物分子溶于此亲水微环境，进而进行萃取的分离方法。,若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过某一临界浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，称为反胶束，,在反胶

44、束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解于水后，就形成了“水池”。,反相胶团萃取的优点：,成本低选择性高操作方便放大容易萃取剂 (反胶团相 )可循环利用蛋白质不易变性等优点。,4. 超临界流体萃取,定义：是将超临界流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某些高沸点或热敏性成分，达到分离和提纯目的。,超临界流体是物质处于临界温度、临界压力之上的一种流体状态，具有气体和液体双重，即密度接近液体，而黏度与气体相似，扩散系数约比液体大100倍。不仅具有与液体溶剂相当的萃取能力，而且具有传质扩散速度快的优点。,具有

45、较高的扩散性，从而减小了传质阻力，这对多孔疏松的固态物质和细胞材料中的化合物的萃取特别有利。对改变操作条件(如压力、温度)特别敏感，这就提供了操作上的灵活性和可调性。具有低的化学活性和毒性。,（1）超临界流体具有以下特点：,超临界CO2成为目前最常用的萃取剂，它具有以下特点： 1. CO2临界温度为31.1，临界压力为7.2MPa，临界条件容易达到。 2. CO2化学性质不活波，无色无味无毒，安全性好。 3. 价格便宜，纯度高，容易获得。因此，CO2特别适合天然产物有效成分的提取。,（2）超临界CO2的特点：,（3）应用,超临界萃取技术具有低能耗。无污染和适用于分离易受热分解的高沸点物质的优点

46、。最适用于分离价值高、难于用常规方法分离的生物化合物。除了用在化工、医药等行业外，还可用在烟草、香料、食品等方面。,超临界流体萃取过程由萃取阶段与分离阶段组成分离,（4）超临界萃取典型流程,等温法：等温条件下，萃取相减压、膨胀，溶质从分离槽下部取出。气体经压缩机加压后返回萃取槽。等压法：等压条件下，萃取相加热、升温，气体和溶质分离。溶质从分离槽下部取出，气体冷却、压缩后回到萃取槽。吸附法：溶质被分离槽中的吸附剂吸附，气体压缩后回到分离槽。,等温法（T1=T2，P1P2）,等压法（T1T2，P1=P2）,吸附法（T1=T2，P1=P2）,11.8 膜分离法,定义：是物质通过膜的传递速度不同而得到

47、分离。,优点：过程一般较简单，操作方便，费用较低，效率较高，无相变，可在常温下操作，既节能又特别适用于热敏性物质的分离纯化，便于维修，有利于生产自动化的推广与普及。,1、膜分离特点 膜的种类、孔径可以根据需要选择 膜对于阻止大的粒子或分子透过的能力很强 把产物分在两侧，很容易收集样品 节能、环保,膜的特性及分离原理,所谓的膜，是指在一种流体相内或是在两种流体相之间有一层薄的凝聚相，它把流体相分隔为互不相通的两部分，并能使这两部分之间产生传质作用。 膜的特性： 不管膜多薄, 它必须有两个界面。这两个界面分别与两侧的流体相接触 膜传质有选择性，它可以使流体相中的一种或几种物质透过，而不允许其它物质

48、透过。,膜分离过程原理：以选择性透膜为分离介质，通过在膜两边施加一个推动力（如浓度差、压力差或电压差等）时，使原料侧组分选择性地透过膜，以达到分离提纯的目的。通常膜原料侧称为膜上游，透过侧称为膜下游。,膜上游 透膜 膜下游,分离膜种类,分离膜,膜分离的物理化学原理,截流机理和筛孔效应渗透和渗透压 Donnan效应,机械截留（筛孔效应） 物理作用或吸附截留架桥作用网络内部截流,2. 膜分离方法的分类,透析超滤反渗透微滤电渗析液膜技术气体渗透渗透蒸发,（1）微滤：微孔过滤，利用孔径0.025m14m的多孔膜，过滤含有微粒的溶液，将微粒从溶液中除去，达到净化、分离和浓缩的目的。推动力为压力差，通常为

49、0.1MPa0.5MPa。（2）超滤：滤膜孔径为lnm20nm，用于过滤含有微粒和大分子的溶液。以压力差为推动力，通常为0.1MPa0.6MPa。,（3）反渗透：用反渗透膜(孔径0.1nm1nm)，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜，截留所有可溶物而得到分离的操作。反渗透也是以压力差为推动力，操作压达3MPa10MPa。,3. 膜的材料、结构和性能参数,膜的要求：透过速度大，选择性高，非特异性吸附低，机械强度好，不易被微生物侵袭，耐热、可高温灭菌，耐化学试剂，廉价等。,（1）制膜的材料,种类：天然高分子材料、合成高分子材料和特殊材料。,实际应用中，目前以纤维素膜和聚砜膜使用最广。,（2）表征膜

50、性能的参数,孔径的性质(包括孔径、孔径分布和孔隙度)水通量截留率和截断分子量抗压能力pH适用范围对热和溶剂的稳定性。,4. 膜的污染与清洗,污染：膜在使用中，尽管操作条件保持不变，但通量仍逐渐降低的现象。原因：膜与料液中某一溶质的相互作用，或吸附在膜上的溶质和其它溶质的相互作用而引起的。,（1）膜的污染,膜的清洗方法 a. 机械方法：加海绵球，增大流速，逆洗（对中空纤维超滤器），脉冲流动，超声波等。 b. 化学方法：水、盐溶液、稀酸、稀碱、表面活性剂、螯合剂、过氧化氢、酶溶液等清洗剂。,（2）膜的清洗,减轻膜污染的方法 a. 对料液进行预处理 b. 制模时改变膜的表面极性和电荷,（3）过滤方式