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1、基因工程技术,1,Jackson, Symons,and Berg (1972) generated first recombinant DNA molecules Cohen and Boyer (1973) produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host vectors carriers of foreign DNA,The Nobel Prize in Chemistry 1980,2,定义：,基因工程（gene engineering） 重组DNA技术（recombina
2、nt DNA technique）：是指在各种酶的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、细菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组DNA分子，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和 表达，这种有目的的应用分子克隆技术,人为的改造基因,改变生物的遗传性状的系列过程,总称为基因工程,3,基因克隆(gene cloning )：是指目的基因与载体DNA连接构成的DNA重组体在受体细胞内进行复制、扩增的技术。,基因表达(gene expression)：是指目的基因在受体细胞内表达，研究功能。,4,应用：,克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。转入原核表达载体，进行大规模
3、蛋白质合成,生产多肽产品。转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调控机制等,5,基因工程基本步骤：,6,基因工程流程示意图,7,构建重组分子（连接）,原料：,目的基因：研究对象载体：目的基因的运载工具工具酶：连接酶、限制性内切酶,8,目的基因片段来源：,基因组DNAPCR 方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它表达或克隆构建或从商品化的cDNA文库扩增）通过RT-PCR 方法得到目的基因cDNA人工合成基因片段（价钱昂贵）,9,目的基因来源选择：,取决于解决什么问题？基因功能研究,cDNA,RT-PCR,基因表达调控的研究,基因组DNA,PCR,10,PCR：,引入合适的酶切
4、位点，一个/两个。加保护碱基，1-3个。加上想要的标签，如 Flag, Myc, His, HA。启始及终止密码子。,高保真聚合酶：HF, Pfu, Probest 等。,11,片断的回收与纯化,12,载体：,载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。种类：,按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ).按作用分：克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、穿
5、梭载体(shuttle vector),13,克隆载体(cloning vector) 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建（PBR322）。表达载体(expression vector) 使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译（pCDNA3）。,14,穿梭载体(shuttIe vector),能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体. 其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的 复制原点或酵母菌
6、的自主复制序列（ARS），它即能在 原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用 于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移。,15,质粒载体,具有复制起始点，这是质粒自我增殖的必要条件。具有较小的分子量，较高的拷贝数，是一个松弛型的质粒。具有某种选择性标记以区别转化和非转化细胞。大多是一些抗菌素抗性基因，赋予受体细胞对某些抗生素的抗性，为转化子选择提供便利。（Ampr；Tetr）具有若干限制性内切酶单一识别位点，便于外源基因插入。,是细菌染色体外能够自我复制的双链环状 DNA 分子。,16,克隆载体: PBR322,特点：分子量小，4.3kb，便于操作。有两个抗性基因，便于转化子筛选。有几个常
7、用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，7种位于四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组和非重组分子。松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停止时，它仍能继续复制。,17,18,19,TA 克隆,A,A,20,TOPO-TA,21,原核 His-tag: pQE系列(Qiagen), pET22(Novagen) GST-tag: pGEX系列(Pharmacia),表达载体：带有调控基因表达所必需的转录与翻译元件，如启 动子等，这些调控元件应与宿主细胞相适应。,22,CDNA3系
8、列 (Invitrogen)，,真核表达载体：大多是穿梭载体。,23,FLAG-CMV系列(Sigma),24,Tet-On/Tet-Off Expression Systems,Tet-Off,pTet-splice(pTet-PTEN)pTet-TAKPSVneo,25,DNA分子的体外连接：方法,粘性末端：相同的粘性末端互相配对进行连接,26,两种情况：,（a）目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接。载体 易自身环化。 用碱性磷酸酶(能除掉DNA-5端P基团，使5端带一 OH)处理载体，可防止载体自 环化。,（b）目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶 切割后连接，可控制目的基因的插入方
9、向(定向克隆)。,27,碱性磷酸酶处理：,28,平头末端：,（1）增加连接酶的量 （连接酶对平末端DNA的Km 约高于粘性末端DNA100倍 （2）在末端加上一个人工接头，内含有一定的限制性内切酶位点，经酶切处理产生粘性末端，然后与载体连接。如加上一个人工接头内含GAATTC序列，用EcoRI酶切，产生EcoRI 粘性末端。,29,30,加同聚物尾： 载体与片段没有共同的粘性末端时，可直接通过末端转移酶分别接上poly（dA）和poly（dT），然后退火，直接转化，分子间空缺部分可以在宿主体内修复。 同尾酶(xho I ;Sal I),其他方法：,Bgl IIAGATCTTCTAGA,BamH
10、 IGGATCCCCTAGG,A GATCTTCTAG A,G GATCCCCTAG G,31,连接策略：,pCMV,32,选择连接位点：,（1）HindIII粘性末端 载体自身环化，四环素失活,方向不确定。（2）EcoRI-SalI-定向，一般不会有载体自身环化，四环素失活（3）XbaI-SalI-反向，不能进行表达。四环素失活（4）目的基因片段：Bgl II -SalI，载体：BamH I -SalI 反向，不能进行表达。四环素失活（5） Not I-修平SalI 一个粘性末端，一个平端 SmaI-修平-SalI 正向连接，四环素失活 PstI ？ SacI ？,33,连接浓度：,片段与载
11、体连接机率自身环化 一般计算公式： 粘性末端： 载体片段含量（ng）/载体长度（kb） 1 DNA片段含量（ng）/ DNA片段长度（kb） 3-5 平末端 1：5 - 10,34,连接反应：,10ul 体系,H2O BufferVectorInsertligase,4/14过夜,连接反应条件 连接酶的活性; DNA的纯度, 载体与目的基因的比例; PH值7.2-7.8适宜; 14(不高于16)过夜,35,连接酶：两种,DNA连接酶：连接双链中两条DNA链之间形成磷酸二酯键，封闭双螺旋骨架缺口。需要一条DNA链的3-末端具有游离的OH，另一条DNA链5-末端的磷酸基团-P，吸能反应，需ATP存
12、在。也可做DNA修复。但不能连接两条单链DNA分子和环化的单链DNA分子。而且只能连接粘性末端。T4DNA连接酶：是从感染T4噬菌体的Ecoli中分离得到的一种连接酶。粘性末端、平末端、平末端上加人工接头。用途比DNA连接酶广泛，是分子生物学研究及基因克隆中较常用的连接酶。,36,其他酶：末端修饰酶,末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase）简称末端转移酶。在合适的反应系统中，这种酶使DNA片段平末端的3-OH加上同聚核苷酸，产生具有 poly（A）、或poly（T）、或poly（G）、或poly（C）的粘性末端。碱性磷酸酶 根据DNA重
13、组的需要，为防止两DNA片段末端之间连接，经常采用碱性磷酸酶处理，使DNA末端的5-P成为5-OH。目前采用的碱性磷酸酶有两种，即来源于大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（BAP）和来源于小牛肠的小牛肠碱性磷酸酶（CIP）。CIP的比活性比BAP高出10倍以上，而且对热敏感，便于加热使其失活。,37,重组子导入受体细胞：,把重组DNA导入受体细胞进行扩增.根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞（原核，真核）及选择适宜的转化或转染的方法。受体细胞的要求：必须具备使外源DNA进行复制的能力（提供复制所需的原料）而且还应该能够表达由导入的重组体分子所提供的某种表型特征，这样才有利于转化子细胞的选择与鉴定。,38
14、,重组子导入受体细胞：途径,转化：质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌（感受态菌）的过程转染：噬菌体、病毒、或以它作为载体构建的重组子主动或被动被导入细胞的过程。 感染：以病毒为载体的重组子，在体外包装成具有感染力的病毒颗粒，通过感染受体细胞，然后整合到受体细胞基因组上。,39,转化,受体细胞：大肠杆菌，基因工程中最常用的宿主细胞转化机理：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变。转化效率： 只有很少比例的细胞有能力掺入质粒DNA 转化时大约在1000个DNA分子中，只有一个DNA分子获得成功。一般每微克完整的pBR322DNA产生105-107 转化细胞,40,感受态菌制
15、备,感受态：细菌细胞处于一个容易吸收外源DNA状态，这种状态的细菌称为感受态菌。 氯化钙法：氯化镁法：电转法：,41,氯化钙法：原理,快速生长的细菌用低渗低浓(50 100mM) 的氯化钙（CaCl2)处理，使细胞肿胀成球形加入质粒后，即于细胞表面形成抗DNAase的羟基-磷酸钙复合物经42热休克后，复合物被细胞吸收。非选择性培养基上生长数小时，球状细胞复原开始增殖,抗生素基因表达。,42,重组子的筛选：,根据重组体 的表型筛选,抗性基因插入失活：生存或是毁灭？,互补现象：蓝白斑筛选,LacZ-受体菌编码半乳糖苷酶羧基端（C端）片断,载体编码一半乳糖苷酶氨基端（N端）的肽,43,插入失活：,4
16、4,互补现象：蓝白斑筛选,45,4290s,+900ulLB,37 45min,Protocol:,3*1ml菌液,沉淀+0.5mlCaCl2,6000rpm 5min,冰浴30min,6000rpm 5min,沉淀+0.1mlCaCl2,+10ul 连接产物,+6ulPBR322,阴性对照,A+T,A+T,阳性对照,Amp,Tet,冰浴30min,46,阳性克隆的鉴定：,挑菌落，小抽质粒，电泳,菌落PCR,94 10 min 30s 40s 1min72 8min 4 hold,X 30,碱裂解法,47,碱裂解法,原理：pH值介于12.0-12.5范围内，线形的DNA和环状的质粒DNA变性，
17、中间的氢键短裂，线状DNA变性后互相分开，而环状分子双螺旋主链骨架彼此盘绕，互补两条链紧密合在一起。变性处理的质粒DNA和染色体DNA通过致冷或恢复中性pH，开始复性。环状分子由于本身合在一起，所以复性迅速而准确。线状DNA变性时彼此分开，复性慢而不准确，互相之间聚集形成较大的网状结构，离心后，与变性蛋白质和RNA一道沉淀下来，上清液中留存下的主要是环状DNA分子和少量的可溶性蛋白质和部分的RNA，这些可溶性蛋白质和部分的RNA可 通过苯酚抽提及RNA酶处理去除。,48,试剂作用：,溶液I-葡萄糖、Tris.HCL、EDTA。低渗，细胞变的脆弱而易于裂解，EDTA螯和金属离子，防止DNA降解。溶液II- NaOH、SDS。 NaOH使细胞裂解，释放出质粒DNA和染色体DNA。溶液III-醋酸钾。降低反应pH值，起中和作用。,49,初步鉴定,50,后续：,测序确定插入序列与基因bank报告完全一致检测外源基因有无整合宿主细胞 ？检测外源基因转录水平表达？检测外源基因蛋白水平表达？,51,
