杂交瘤技术和单克隆抗体技术PPT课件.ppt

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1、第四讲 杂交瘤细胞和单克隆抗体技术,第一节、免疫的基本知识,一、免疫系统:分非适应性免疫和适应性免疫两类。 1、非适应性免疫是由非特异性反应的细胞介导的。如:巨噬细胞的吞噬作用,泌细胞分泌的溶菌酶,以及中性细胞造成的细胞裂解机制。 2、适应性免疫:是针对特定分子,而且可经反复暴露于外源分子使之加强淋巴细胞合成细胞表面受体或分泌特异性蛋白结合外源分子。这些分泌的蛋白称为抗体;可与抗体结合的分子被称为抗原。当一个分子被用于诱导适应性反应时,这个分子就被叫做免疫原。,.,3、免疫系统含有109以上淋巴细胞遍布全身,保证了它们在任何部位都能迅速反应。淋巴细胞由骨髓中的原始干细胞不断产生,经血液及淋巴系

2、统循环,暂时停顿并积聚于称作淋巴器官的特异化的结构中,在哺乳动物中就是淋巴结和肝脏。在免疫反应过程中,免疫原积聚于一个淋巴器官中,这个淋巴器官就变成了免疫反应的焦点。 B细胞:分泌抗体,并在细胞表面携带同一抗体的修饰型,功能相当于受体。 毒性T细胞:携带结合抗原的细胞表面受体。 辅助T细胞:在控制B细胞和细胞毒性T细胞反应方面起关键的调节作用。,.,体液介导的适应性免疫反应:体液反应引发产生可结合外来抗原的循环抗体,由B淋巴细胞产生,由辅助T淋巴细胞介导是抗体技术的基础。 细胞介导的适应性免疫反应:毒性T淋巴细胞结合于外来或感染的细胞,随后将这些细胞裂解,辅助T细胞参与该反应。二、免疫系统能特

3、异性地对无数种分子反应。 免疫系统持续地受无数抗原刺激。免疫系统的一个主要形式是它能合成大量的抗体及细胞表面受体。各个带有不同抗原结合位点的抗体和T细胞受体与外来分子的结合提供了免疫反应特异性的基础。,.,三、个别淋巴细胞识别个别抗原一个细胞识别一个抗原,因为单一淋巴细胞上的所有抗原受体是相同的。在成熟淋巴细胞表面的所有受体都是糖蛋白,体细胞基因重组、突变及基因转录后加工等使受体产生107个以上的结合位点。抗原特异性通过确保只有一个类型的受体在一个细胞内被合成的过程来维持。虽然B细胞表面抗体和T细胞表面受体都具有类似的结构,但它们是由不同的基因家族编码的,其表达具有细胞型的特异性。B细胞上的表

4、面抗体能结合可溶性抗原,而T细胞受体仅仅识别在其它细胞表面展示的抗原,.,四、免疫系统能将外来微生物和分子与自身成分区别开来。五、系统记忆每一次与外来抗原的遭遇 免疫反应遇到同一抗原时一次比一次强,具有特异性。免疫记忆可以延续动物终生。六、免疫反应的许多性质是通过克隆选择确定的 一种抗原活化一种淋巴细胞。当淋巴细胞表面受体结合抗原时,B淋巴细胞就被活化,分泌抗体被刺激而增殖(急剧分裂克隆)。七、一个有效免疫系统的成熟是由广泛的细胞间信息交换来调节的。,.,第二节、抗体分子抗体是具有共同结构和功能形式的一大类糖蛋白。抗体分成五类:IgG、IgM、IgA、IgE和IgD(见表2-1)。一、IgG类

5、抗体有两个相同的抗原结合位点含有抗原结合位点的两个区域被称作Fab片段,涉及到免疫调节的蛋白区称作Fc片段,在Fab和Fc片段之间的部分称作铰链区。重链分子量为5.5kDlt;轻链分子量为2.5kDlt。二、不同类型抗体的区别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD因重链形式不同而有所区别。它们的重链分别称作、和。重链的不同使这些蛋白具有不同形式的免疫功能,并且在完成反应成熟的不同阶段发挥作用。这些差异主要是由于Fc片段上的蛋白序列不同所致。轻链只有两种:、。,.,.,.,.,五、重链和轻链的可变区形成抗原结合位点一个重链的可变区和一个轻链的可变区结合形成一个抗原结合位点。可变区的异质性提供了动

6、物有效进行免疫反应所需的无数结合位点的基础。序列异质性并不是由整个可变区的每一部分决定的,而是集中在与抗原接触的位点上。多数可变性决定于每一个链的三个短区,它们形成轻链的三个超变区和重链的三个超变区。这些超变区形成抗原抗体结合的接触残基的主体,同时这些超变区位于扩展进入抗原反应区的短环上。由于它们是实际的抗原结合位点,故被认为是互补决定区。六、功能性、轻链和重链基因的一个明显特征是在所有细胞中这些基因转录后的选择性剪接是不同的(见图2)。200个V区,4个功能性J区。七、形成轻链pre-mRNA外显子也要重排(图3)。V-J-C-J-C。八、形成功能性重链基因需要pre-mRNA外显子的重排(

7、图4)。50100种可变区,12个D区,4个J区。,.,.,.,.,.,.,九、这些重组及其它机制产生了无数的抗原结合位点。十、等位基因排斥确保在任一B细胞中只有重新排列的一个轻链和一个重链被表达。产生不同重链和轻链的基因重组不总是产生一个功能基因,在B细胞分化过程中,轻链重排开始于区内。然后,若二倍体基因中的一个首先重排,产生一个功能性等位基因,另一个拷贝则进行重组。若二个重组都产生非功能性等位基因,那么重组就要位点开始,以同样的机制产生功能性重链。一旦重组产生一个功能性抗体,一个未知的机制就制止进一步重组。将抗原性结合位点固定,直到细胞死亡。这个机制叫等位基因排斥。它可以解释为什么B淋巴细

8、胞分泌的只有一种抗原结合位点的抗体和抗体只有一种类型的轻链。十一、其它:重组被用于生产各种类和亚类的抗体。,.,淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体技术,1960年,法国的Barski等首先发现,两种不同类型的细胞在混合培养的过程中会自发融合形成融合细胞。与此同时,日本的Okada也发现紫外线灭活的仙台病毒(Sandai virus)可以诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合,在此基础上用灭活的仙台病毒诱导产生了第一个种间的杂交细胞。 1976年Kohler和Milstein创建了一个方法,他们将分泌一种特异性抗体的B细胞和体外持续生长的浆细胞瘤融合,产生的杂交细胞克隆表达了抗体生成的正常B细胞和浆细胞瘤细胞的免疫

9、球蛋白基因,同时也具有在体外无限增殖的能力。为此创造了杂交瘤(hybridoma)这个名词,以描述一个正常抗体生成细胞和一个浆细胞瘤细胞的融合产物。由于他们的重要科学贡献,Kohler和Milstein在1984年荣获了诺贝尔医学生理奖。,.,.,一、免疫原性,许多外源分子、病毒或细胞单纯注射在实验动物体内能引起强的抗体反应,而一些物质却不能,对于这些情况,常可通过修饰抗原或改变宿主而使免疫系统反应增加。 好的免疫原分子必须具备以下条件: 1、抗原结合于原始B细胞表面抗体分子对于抗体反应是绝对必要的。这个结合决定了产生抗体的特异性。因为表面抗体分子上的抗原决定位点与分泌抗体的结合位点是一致的。

10、 2、它必须能促进B细胞与辅助T细胞间的信息交换。这要求在两个细胞间有物理连接。即有一个位点被II级蛋白及T细胞受体所识别。 3、通常它必须可被降解。,.,二、抗原来源 开始一个免疫程序之前,对制备抗原的考虑主要于抗原所需的剂量和纯度。这应基于预计产生抗体的用途。如果仅仅需要识别相应抗原的高特异性抗体,那么抗原必须要相当纯,或抗原制备物用于制备单克隆抗体。 1、纯抗原 2、从聚丙烯酰胺凝胶中纯化抗原。 3、半抗原:半抗原若被偶联于大的蛋白分子上就能被用于诱发抗体。半抗原起抗原决定簇作用,与B细胞表面抗体结合,载体提供II级T细胞受体结合位点。总之,半抗原应被偶联于可溶性载体上,如BSA。 4、

11、合成多肽也要连接到载体上。,.,三、动物免疫,1、动物选择 Balb/c小鼠,68周龄;兔子生后约12周。 动物数:小鼠46只;兔子24只。2、佐剂 免疫反应的非特异性刺激物叫做佐剂,诱导对可溶性抗原的抗体反应必须使用佐剂。但对颗粒性抗原或全细胞抗原则不是必须的。 佐剂包含两种因素:一是佐剂是储备性物质以防止抗原迅速代谢;二是佐剂必须是可以非特异性地刺激免疫反应的物质。实验时一般是将水溶液注入到佐剂中。3、抗原剂量 对于兔,若有大量可溶的纯抗原可用,一般认为每次免疫于佐剂中有0.51.0mg剂量是可取的;对于小鼠来讲,剂量则降10倍,为50100g。,.,4、抗原的形式5、注射途径:需考虑三个

12、问题。 1)要注射多大剂量; 2)与免疫原同注的是什么缓冲液,还有其它什么成分; 3)免疫原释放入淋巴系统及循环系统的速度如何? 对于兔,大体积注射常采用皮下多点注射。 对于鼠,大体积注射常采用腹腔注射,若需缓慢释放则采用肌注或皮下注射,若需立即释放宜采用静脉注射。 对于鼠来说,第二次和第三次免疫应间隔至少3周。 对于兔来说,每36周注射一次。 超免疫化动物血清主要含IgG抗体。其实质部分为特异性抗体。抗原特异的IgG水平可达1mg/ml,这几乎等于血清中总IgG水平的10%。,.,.,杂种细胞的筛选:细胞融合带有一定的随机性,除不同亲本细胞间的融合外,还伴有各亲本细胞的自身融合。因此,在紧随

13、细胞融合之后,必须设法把含有两亲本细胞染色体的杂种细胞分离或筛选出来。最简便的办法无疑是应用选择培养基,使亲本细胞死亡,而仅让杂种细胞存活下来。为此,已先后利用亲本细胞的药物抗性、营养缺陷型和温度敏感性等遗传标记,建立了多种选择系统,并已成功地用于杂种细胞的筛选。,.,由抗药性细胞组成的杂种的筛选: Szybslski等(1962)在研究抗药性时发现,抗嘌呤类似物8-氮鸟嘌呤或6-巯基鸟嘌呤突变型细胞缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT),而抗嘧啶类似物5-溴脱氧尿嘧啶突变型细胞缺乏胸腺嘧啶核苷激酶TK),它们均可为HAT培养基所杀死。在此基础上,Littlefield(1964)进一步应用

14、HAT培养基来筛选HGPRT细胞与TK细胞的余种细胞,获得成功。从此,根据抗药性这一遗传标记设计选择系统即日益增多,而发展成为迄今使用最为普遍的一种筛选方法。其代表性的选择系统有下列几种。,.,HAT选择培养基:HAT培养基是指在细胞培养基中加有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)或氮丝氨酸(A)和胸腺嘧啶核苷(T)的培养基。细胞为合成DNA所需要的嘌呤和嘧啶,可由两条途径获得。一条为主要途径,即从磷酸核糖焦磷酸(PRPP)和谷氨酰胺合成肌苷酸(IMP),进而转变为脱氧鸟苷三磷酸(dGTP),及从脱氧尿苷酸(dUMP)合成脱氧胸苷酸(dTMP),再转变为脱氧胸苷三磷酸(dTTP)。这一合成途径,可为加入的会抑制为嘌呤或嘧啶合成提供甲基的二氢叶酸还原酶的叶酸类似物A所阻断。此时,只有HGPRT+和TK+细胞才能通过另一条应急途径,利用外加的核苷酸的“前体”H来合成IMP和利用T来合成dTMP,而得以有活下来。相反,HGPRT和TK细胞则将因无法利用H和T来合成DNA而死亡。因此,在HGPRT和TK细胞融合后,应用HAT培养基即可将通过基因互补而同时获得HGPRT和TK酶的杂种细胞筛选出来。,.,

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