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1、1,流式细胞术的原理及应用,临床实验诊断教研室 施琼,2,流式细胞术（Flow Cytometry, FC/MFACS）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,流式细胞术的概念,3,流式细胞仪特点,单细胞悬液或生物颗粒,分析速度高,多参数,精度高,当代最先进的细胞定量分析技术,4,FACS Calibur,特点：光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备1-2根激光细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析,临床型
2、（台式机）,5,BD LSR,6,FACS Vantage DiVa,科研型（大型机）,特点：多数字化适用于各类细胞分选4路分选,7,FACSAria,科研型,特点：分辨率高选配多种波长和类型激光器可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析,8,流式细胞仪检测范围,细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞结构,特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体,细胞功能,9,流式细胞术发展简史,1934年，Moldavan开创流式细胞自动计数的基础。1950s，Coulter公司设计细胞
3、自动计数器，初步解决了流动细胞的通路问题。1965年，在细胞分选中应用了超声震动器。 1969年，Stanford、California大学的研究组发明了第一台较满意的流式细胞仪。1972年，FACS-型仪器试制成功，并在美国建国200周年纪念会上与人造卫星并列展示。,10,流式细胞仪的工作原理,11,FCM的工作系统,1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞悬液。,12,2.光学系统：激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。3.数据处理系统：对实验数据分析、存储、显示。具有智能化、自动化特点
4、。,13,流式细胞仪仪器结构,液流系统光学系统激光光源 光收集系统电子系统 光电转换 数据处理系统细胞分选系统,14,液流系统：流动室、液流驱动系统,15,液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱,16,光学系统,入射光系统：激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照。发射光系统：散射光和荧光光收集系统是由若干组透镜、滤波片和小孔组成,将产生的光信号引导至检测器,17,入射光激光光源,单波长、高强度、高稳定性多采用氩离子激光器或氦氖激光器一般选配2-4根激光，488nm 、633nm、355nm和407nmUV激光最多检测13个荧光参数,18,19,发射光,散射
5、光信号 前向散射光（foword scatter, FS）：在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。 侧向散射光（side scatter， SS）：与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。荧光信号,20,散射光,FSC（小角散射光)它反应细胞的相对大小和截面积的大小SSC (90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化,全血细胞流式FSC-SSC图,它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分,21,Forward Angle Light Scatter,22
6、,90 Degree Light Scatter,23,Laser,Fluorescence Detectors,Purdue University Cytometry Laboratories,24,Longpass Shortpass Bandpass,光收集系统：滤光片,25,26,27,细胞分选系统,28,当含细胞的液滴逐个通过激光束时，受到两种检测器的检测:如果液滴中含有细胞就会激活干涉检测器(interference detector)，只有带有荧光标记细胞的液滴才会激活荧光检测器(fluorescence detector)。当带有荧光标记的液滴通过激光束时，将两种检测器同时激活
7、，引起液滴充电信号使鞘液带上负电荷。由于液滴带有负电荷，移动时就会向正极移动，进入到荧光标记细胞收集器中。,细胞分选的原理,29,30,信号检测-荧光信号,31,32,33,34,35,光路荧光信号,每种荧光染料都有特定的激发波长和发射波长，流式细胞仪利用不同波长的光学滤片来检测这些特定发射波长的光学信号。长通滤片允许长于设定波长的光通过 短通滤片允许短于设定波长的光通过 带通滤片允许一定带宽波长的光通过 二向色性滤片当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光,36,荧光信号,荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能释放较入射光
8、波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强,37,38,39,40,41,流式细胞仪的电子系统,进行信号检测和分析当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度电脉冲信号经A/D转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析,42,数据处理,检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式可供选择单参数数据 以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。双参数或多参数数据 既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择
9、二维的散点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。,43,流式细胞仪数据分析（1）,直方图分析,X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率,单参数直方图（Histogram）,44,流式细胞仪数据分析（2）,点图分析,便于数据统计不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式,45,流式细胞仪数据分析（3）,二维等高图和密度图,46,47,流式细胞仪的应用,48,临床研究,淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、造血干细胞移植监测、 HLA-B27分析、PNH诊断、人类
10、同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度,49,基础研究,淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究,50,51,抗体的选择,首选直接标记抗体根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原使用双标以上抗体必做荧光补偿,52,光谱交叉,两色以上荧光分析存在 光谱交叉,53,荧光补
11、偿方法,所有补偿调为“0”调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”依单阳群体调节荧光补偿,54,流式细胞术样品制备的要求,制备单细胞悬液是流式细胞分析的基础。标本应新鲜；采用密度梯度离心分离外周血淋巴细胞，在分离和洗涤过程中应避免高速离心而致细胞膜结构破坏。常用溶血剂处理红细胞。温度和pH：25-370C，pH 7.0-7.2。制备实体组织标本的单细胞悬液时多采用机械法，而少用化学法或酶消化法。被检细胞或颗粒大小0.280um样品中至少20000个细胞，浓度105-107个/毫升,55,实验对照的设计,空白对照：阴性对照： 常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同
12、型对照，单阳性对照（用于仪器校正）阳性对照：检测阴性时,56,实验标本的处理,单细胞悬液的制备：胰酶消化抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体,57,特别提醒注意,荧光染料浓度的控制：合适的荧光染料浓度是保证最佳信号产生的重要技术指标。 1106/ml细胞，用20l荧光标记的单克隆抗体（0.1-1 g/ ml)。常用固定剂：细胞周期测定时应将细胞用PBS洗涤三次后用70%冰乙醇固定，在40 C保存数月；荧光染色后不能及时上机检测，可用1-4%多聚甲醛固定， 40 C保存。,58,同型对照：为阴性对照；实验中选用的大鼠或小鼠源性标记单抗，就一定选用相
13、同源性的标记单抗作为同型对照来调整设置电流电压。上机前一般需过目：200-300目全程质控：从样品制备和标记、溶血、洗涤、仪器质控和上机检测，需全程质控。,59,样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋,单细胞 悬液,标记荧光抗体,检测,表型测定,细胞分选,流式细胞术操作流程,统计学 分析,继续培养,60,细 胞 周 期 分 析（DNA倍体分析）,61,细胞周期、DNA倍体分析原理,PI（碘化丙啶）是一种DNA结合剂，能非特异性嵌入到死细胞的DNA、RNA上；细胞经Triton X-100或NP-40打孔，把染料引入细胞内，经过一段时间染色后，用FCM检测，可判断DNA的相对含量。,62,样品制备,100
14、0rpm 5分钟收集2X106个细胞,PBS漂洗 两次,70%酒精4固定过夜,收集固定的细胞,PBS漂洗,0.5ml PBS悬浮细胞,2.5l 10g/l RNase A,37消化1小时,过300目细胞筛,50l 0.1mg/ml PI（含1%Triton)，,1000rpm 5分钟 离心,两次,混匀，室温静止5分钟,上机,63,建立获取模式，获取数据 （PI单染分析细胞周期，同时看凋亡）,去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用,64,G0-G1,S,G2-M,Fluorescence Intensity,# of Events,A typical DNA Histogram of cell prol
15、iferation,65,数据分析,圈门去除细胞碎片，分析细胞凋亡,圈门去除粘连体，分析细胞周期,66,细胞凋亡分析,67,凋亡细胞的特点,在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏凋亡细胞的FSC降低，SSC增加。细胞坏死时，细胞肿胀，FSC增大，SSC也增大,68,FCM在细胞凋亡检测中的应用,DNA含量分析Annexin-检测法TUNEL检测与凋亡相关的蛋白测定，如APO 2.7，Bcl-2, Bax, Fas, FasL等检测,69,DNA 含量分析 凋亡的细胞因核酸内切酶的活性
16、增强，使DNA分裂成一些小片段，这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡细胞的 DNA含量相对减少，因此在DNA的直方图上出现一个位于 G1峰左侧的小峰（亚G1峰），称为AP峰。 FCM的DNA分析检测细胞凋亡存在一定的局限性。比如，机械处理的肿瘤标本常有许多碎片，在 DNA直方图上出现较宽的杂信号峰，使凋亡细胞被“淹没”其中，不少文献将G1峰前的所有信号均算为凋亡细胞，可能会过高计算凋亡细胞的数量；因此在评价细胞早期凋亡时，该指标不够灵敏。,70,71,Annexin 磷脂结合蛋白作为探针识别细胞膜表面磷脂酰丝氨酸 细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸（PS）可
17、以迁移到细胞外层表面。巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症反应。Annexin 是一种Ca离子依赖的、对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜是否有PS而识别凋亡细胞，由于坏死细胞也可能在膜表面出现PS，故需要同时进行染料（PI）排斥实验，凋亡细胞膜完整，不能染色。,Annexin-检测,72,Annexin V/PI双染活细胞为（Annexin V-/PI-）坏死细胞为（Annexin V+/PI+）凋亡细胞（Annexin V+/PI-）,73,细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞 Sub-G0/G1 peak
18、s - PI staining,74,75,Annexin V Assay建议用于悬浮细胞,76,Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡,77,Annexin V-PE/7-AAD双染色法,双阴：活细胞 Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞双阳：晚期凋亡细胞 7-AADd单阳：坏死细胞,78,TUNEL检测,79,注意：,细胞凋亡FCM分析必须与形态学分析、DNA电泳等一系列常规检测方法结合，综合分析，才能给予正确的评价。,80,人外周血淋巴细胞亚群检测,81,(1) 淋巴细胞亚群分析 T细胞： CD3+ CD4+ (Th) CD8+ (Tc) B细胞： CD19+ CD3-
19、NK细胞： CD3- CD16+ CD56+,82,83,根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将CD4+、CD8+分为 CD4+: T h1: CD4+ IFN-r+ Th2: CD4+ IL4+ Th0: CD4+ IFN-r+ IL4+ CD8+: Tc1: CD8+ IFN-r+ Tc2: CD8+ IL4+ Tc0: CD8+ IFN-r+ IL4+,84,辅助性T细胞亚群的生物学功能及临床意义Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。Th
20、2细胞 ：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。Th1/Th2细胞平衡偏移多见于：感染症、自身免疫病、过敏症、排斥反应、免疫缺陷、肿瘤恶化等。检测Th1/Th2细胞平衡主要是分析疾病发生发展的状况，为临床调整Th1/Th2细胞平衡偏提供正确的治疗依据。,85,(3) 淋巴细胞功能分析：细胞介导细胞毒试验、细胞内细胞因子的测定 自身免疫性疾病 变态反应性疾病 免疫缺陷性疾病 感染性疾病(病毒、细菌、寄生虫感染) 免疫治疗监测 肿瘤免疫监测 移植免疫监测,86,87,88,89,90,91,思考题,FCM的检测信号分为哪些？各种检测信号反映了细胞的哪些生物学特性？举例说明FCM在免疫学及生物医学中应用包括哪几方面？,
