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1、动物的克隆,动物细胞与组织培养,克隆培养法,单克隆抗体,细胞核移植,动物的克隆常用技术,动物细胞融合,动物克隆的技术基础是动物细胞与组织培养细胞工程的主要手段是细胞培养和细胞融合,资料：培养细胞的生存环境,1.无菌、无毒环境：添加一定量的抗生素，定期更换培养液2.适宜的温度和PH：35-37;PH:7.2-7.43.气体环境（CO2培养箱）4.特殊的培养液：主要有：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等,调节PH，模拟人和哺乳动物细胞在体内的最适环境,思考：较植物组培培养基有何独特之处？,1.液体培养基；2.葡萄糖.3、动物血清,含激素，保证细胞顺利生长增殖,细胞的全能性,细胞株、细胞系,
2、植物体,培养结果,获得细胞或细胞产物,培育新植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物细胞和动物细胞培养的比较,一、动物细胞培养,首先，将动物体内的一部分组织取出，经过机械消化或胰酶消化，使其分散成单个细胞；然后，在人工控制的培养条件下，使这些细胞得以生存，并保持生长、分裂乃致接触抑制和有规律的衰老、死亡性能等生命活动现象。注意：细胞之间在生命活动中相互依存，所以也像体内一样呈现一定的组织特性。,细胞贴壁,细胞贴壁：细胞培养时，悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁
3、。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。,在培养的过程中，细胞会结构和功能的变化,细胞在贴壁生长过程中,随着细胞分裂,数量不断增加,最后形成一个单层,此时细胞间相互接触,细胞分裂和生长停止。,接触抑制,成纤维细胞型：,思考几个问题,1、在大多数细胞培养中都不直接使用人的皮肤作为材料而是选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织,为什么？2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？3、胰蛋白酶的作用？胃蛋白酶可以吗？4、为什么要分装？5、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,培养的细胞会因细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭，不能正常生长。,不能，动物细胞培养只能使细胞数目
4、增多，不能发育成新的动物个体,因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强,成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养,有关概念,原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。一般是指从开始到传至10代细胞的培养,传代培养：将原代细胞分成若干份，接种到其他培养基中，使其继续生长繁殖。 传代培养一般指10-50代细胞的培养,细胞的原代培养,将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。,胰酶消化法,1、取材：用手术剪将组织剪成小块（1mm2），再洗三次，转移至小青霉素瓶中。4
5、、视组织块量加入胰酶液，37中消化2040分钟，每隔5分钟振荡一次.5、加入2ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）,用吸管吹打，冲散细胞。6、静置，使未分散的组织块下沉。7、吸取上层细胞悬液，转移到两个培养皿中，补加适量培养液，37下培养。,（一）培养细胞生命期在培养中持续增殖和生长的时间。,1原代培养期：从体内取出组织,接种培养到第一次传代阶段（初代培养）特点：细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似性、多呈二倍体核型细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。,2传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长
6、。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。,3衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性。,细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死
7、性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。,总结,转化的细胞可能获得永生性或恶性异体致瘤,永生性也称不死性，又称无限细胞系，也称连续细胞系，大多变成异倍体,有限细胞系 （二倍体）,细胞系、细胞株,细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞，称为细胞株。特点：一般具有恒定的染色体组型、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等。,细胞系：异质性细胞株：纯系,如何获得纯系的细胞系？,把一个细胞从群体中分离出来单独培养,（克隆培养法）,二、克隆培养法,1、克隆培养法概念：把一个细胞从群体中分离出来
8、培养，使之繁殖成一个新的细胞群体的技术。（克隆培养与群体培养是一个等位概念）2、特征：纯系（遗传性状均一、表现性状相似）3、基本要求：必须保证分离出来的细胞是一个而不是多个。4、克隆的难易程度:单细胞不如群体细胞原代细胞、有限细胞系连续细胞系、转化或肿瘤细胞5、提高克隆形成率的措施：选择适宜的培养基、添加血清（胎牛血清）、滋养细胞（如经射线照射本身是去增值力的小鼠成纤维细胞）、激素（胰岛素等）刺激、 CO2培养箱、调节PH值等6、用途：如从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。,三、动物的细胞融合技术及其应用, 什么是细胞融合技术？, 为什么要进行细胞融合？, 如何实现细胞融合？,定义
9、指用自然或人工方法,使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。 不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。,1、动物细胞融合,受精作用,两个细胞正在融合,诱导融合的因素生物法：灭活的仙台病毒诱导融合 利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。 这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。 化学法：聚乙二醇诱导融合 因为聚乙二醇易得、简便，且融合效果稳定，是目前应用最广泛的方法。物理法：电刺激诱导融合,病毒颗粒黏 附细胞表面,细胞膜连接,细胞膜被 病毒颗粒穿通,细胞融合、形成杂种细胞,5、应用,1.由于细胞杂交中染色体容易丢失，因此利用杂交
10、细胞检测特定染色体丢失与特定基因产物减少的对应关系，可以进行基因定位。3.利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。,2.克服远缘杂交不亲和的障碍,鼠鸡、鼠兔、鼠猴、人鼠、人兔、人鸡、人蛙、酵母菌鸡 、人胡萝卜等,此技术有什么缺点和优点？,小鼠单克隆抗体的制备,杂交瘤的制备,融合前的准备工作细胞融合杂交瘤细胞的筛选单克隆抗体的大量制备,主要设备,净化工作台 超净工作台是一个无菌操作装置，其原理是内设鼓风机，驱动空气通过高效滤器净化后，让净化后空气徐徐通过台面空间，使工作场地构成无菌环境。,组织培养材料的准备,主要设备,CO2恒温培养箱 骨髓瘤和杂交瘤细胞培养都需要在恒定温度条件下才能生存，温度变化一般不
11、应超过0.5度。因此要求培养箱应具有较高的灵敏度；电热恒温箱质量关键在于控温装置的优劣。CO2恒温培养箱已成为普遍应用的设备，优点是箱内能恒定地提供一定量的二氧化碳，通常用5%，可使培养液维持稳定的pH，减少调pH的麻烦。,组织培养材料的准备,主要设备,离心机 培养细胞经常需要制备细胞悬液、漂洗，需离心分离细胞，要求每分1000转左右，故一般小型台式离心机即符合要求。,组织培养材料的准备,主要设备,培养液过滤装置 各种培养用液只能用过滤的方法进行除菌做消毒处理。现多用微孔滤膜，密度有不同型号，尺寸有不同规格。,组织培养材料的准备,主要设备,多孔培养板、塑料器皿,组织培养材料的准备,骨髓瘤细胞悬
12、液的制备,骨髓瘤细胞,扩大培养,50ml离心管,1000r/min离心5-10min,离心洗涤,骨髓瘤细胞悬液,活细胞计数后备用,融合前48-36h,融合当天,30ml不完全培养基,10ml不完全培养基,0.4%台盼蓝染液,脾细胞悬液的制备,小鼠脾脏,直径10cm平皿,剥离周围结缔组织,剪刀剪碎、注射器芯挤压,单细胞悬液,直径10cm平皿,10ml不完全培养基,铜网过滤,10ml不完全培养基,轻轻洗涤,脾细胞悬液的制备,脾细胞悬液,1000r/min离心5-10min,离心洗涤1-2次,脾细胞悬液,活细胞计数后备用,50ml不完全培养基,10ml不完全培养基,0.4%台盼蓝染液,1,2,3,4
13、,1,2,3,4,单克隆抗体,细胞融合,取出脾细胞,+癌细胞,各抗体分开,传统抗血清,抗 原,免 疫,所有抗体混合,1,2,3,4,B 细胞,抗原免疫小鼠后，其脾脏会产生分泌抗体的各种 B细胞。,每种 B 细胞只能分泌一种抗体，对抗各自的抗原决定基。传统抗血清便是所有抗体的混合，得以有效保护动物个体。,假如能够把单一个 B细胞挑出来培养，则可收获单一种抗体。但是，B 细胞无法在试管中培养生长。,癌细胞可以在试管中持续培养生长，但无法产生所要的抗体。,这些单独的融合细胞可以大量生产单独一种抗体，就是单克隆抗体。,若把 B 细胞与癌细胞融合，所得到的融合细胞则可分別培养。,骨髓瘤细胞,脾细胞,杂交
14、瘤细胞,融合后细胞的类型:,杂交瘤技术的理论基础,融合细胞筛选技术,融合细胞筛选技术,生化代谢缺陷型骨髓瘤细胞系,单克隆抗体产生的原理,HAT培养基,根据筛选杂交瘤细胞的特殊培养液。,融合后细胞在HAT培养基中存活情况,不能长期生长,死亡,生化代谢正常,能够长期生长,生长繁殖,死亡,生化代谢缺陷,能够长期生长,生化代谢正常,杂交瘤细胞的筛选,脾细胞,骨髓瘤细胞,细胞融合,HAT初步筛选,筛选阳性克隆,单克隆抗体产生的原理,操作步骤,筛选阳性细胞克隆,每孔加待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性（免疫鼠血清）、阴性对照（完全培养基）和空白对照。,单克隆抗体的大量制备,动物体内生产法体外培养法,小鼠
15、腹水诱导,细胞培养液,制备杂交瘤培养上清,杂交瘤细胞扩增,1:10比例转入新瓶,离心、收集上清,检测抗体滴度,分装、无菌保存,37 5CO2,5d,制备单克隆抗体腹水,动物体内生产单抗是最实用的大量制备单抗方法。使用动物首选BALB/c小鼠。原理：将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。注射细胞前一般先用降植烷或液体石蜡处理腹腔，以便产生大量腹水。缺点：腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig）；有污染动物病毒的危险。,制备单克隆抗体腹水,腹腔接种降植烷或液体石蜡（0.5-1ml/只）,7-10天,腹腔接种无血清培养基稀释的杂交瘤
16、细胞，5105/只,制备单克隆抗体腹水,7-10天采集腹水,2000r/min，5min,收集上清，测定抗体效价,分装，冻存备用,思 考：,（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？,细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。,（2）骨髓瘤细胞是癌细胞吗？,有无限增殖能力的细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞，所以瘤细胞不能等同于癌细胞。,（3）制备过程为何要经过两次筛选？,第一次筛选获得多种杂交瘤细胞 第二次筛选出特异抗体的杂交瘤细胞。,(5) 本过程利用了哪些
17、原理？,免疫原理、细胞融合原理、动物细胞培养原理,（4）制备过程中应用哪些细胞工程技术手段？,细胞融合技术、细胞培养技术。,动物细胞融合技术,B 、BB 、B瘤 、瘤瘤 、瘤,只有杂交瘤细胞才能活,获得产生相应抗体的B淋巴细胞,获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞,获得杂交瘤细胞,1975年，米尔斯坦（英）和科勒（德）,融合,选择性培养基,抗体检测,问题探究,1.第一次筛选和第二次筛选的目的有何不同？2.单克隆抗体有何特点？,单克隆抗体的优点：化学性质单一，特异性强，灵敏度高。,第一次筛选：用选择性培养基获得杂交瘤细胞。第二次筛选：通过抗体检测获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞。,四、动物的克隆繁殖,理
18、论上，分化的动物细胞能像植物细胞一样脱分化、再分化成一个动物体吗？ 动物细胞实际上表现出全能性的情况如何呢？,受精卵,胚胎干细胞,多能干细胞,单能干细胞,体细胞,四、动物的克隆繁殖,（一）动物细胞全能性的表现程度,如多能造血干细胞：可分化为红细胞、白细胞、血小板等,（2）低等动物细胞：全能性一般容易体现。如水螅的上皮细胞，不经过分裂就可以转变为上皮、肌肉细胞。,（1）高等动物细胞,（二）动物难以克隆的根本原因,在动物的个体发育过程中，分化的结果使得细胞在形态和功能上高度特化，这是由于细胞在伴随着它们发育过程中在时间、空间的变化，基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质。,动物的基因组中，一类
19、基因是维持生存的，在各种细胞中都处于活动的状态。另一类基因随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达。分化的细胞内基因的活动很不完全，因此很难像受精卵那样发挥细胞全能性。,胚胎细胞核的移植成功率远高于成体细胞,(三)细胞核移植实验和动物的克隆繁殖,1、过程：利用一个细胞的细胞和来取代另一细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”,胚胎细胞核移植,体细胞核移植,绵羊“多莉”克隆过程：,具体操作,取6岁母绵羊（芬兰多塞特白品种绵羊）的乳腺细胞作核供体细胞，用“饥饿法”使其进入休眠状态而使全部基因具有活性。注射促性腺激素GN促使母羊（苏格兰黑面母绵羊）排卵，2833小时取其未受精卵快速去核，放入10%FCS
20、（小牛血清）、1%FCS和0.5%FCS连续5天，饥饿使进入G0期做受体细胞。,在乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中，在微电流作用下，将乳腺细胞核融入卵中，形成一个含有新遗传物质的卵细胞。将新的卵细胞发育成桑椹期胚胎或囊胚，再移入假孕母羊子宫内。产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。,供体和受体的准备,核移植成功的重要前提：,尽量保证核供体和受体细胞处于同样的细胞周期（同步状态）,如何使处在细胞周期不同阶段上的核供体和受体处于同步状态？,饥饿技术,即在供体细胞的培养基中降低营养物质（血清）的浓度，使供体细胞处于“饥饿状态”，停止分裂增殖而休眠。休眠的细胞核进入去核的卵细胞后，在卵细胞的细胞质作
21、用下重新启动分裂程序。这样，供体的细胞核与受体的细胞质才能在分裂相上相互协调，配合细胞才能分裂发育。,去卵膜和卵核,如何给受体细胞去核？, 显微操作 紫外照射 细胞松弛素结合高速离心,供体细胞制备,如何获取供体细胞核？, 显微操作 细胞松弛素结合高速离心 核体 胞质体,二、克隆的技术方法,将受体卵细胞 去核,向去核卵细胞植入供体细胞,移植后的细胞激活后可以象受精卵一样发育形成动物个体，并具有与核供体细胞相同的基因,移核,移植后重组细胞的激活、培养、胚胎移植, 激活（P52）（使卵母细胞从M II 期解放，转到“受精”状态） 重组胚的体内或体外培养 胚胎移植,重构卵的激活,正常情况下,受精过程中
22、，精子进入卵子后,卵母细胞质中会出现一系列的反应,如母源性的mRNA启动转录等。这些反应是卵母细胞被激活的标志，不经过这些变化,胚胎就不能正常发育。 核移植过程中的激活就是模仿受精过程中精子的刺激作用。 目前，激活的方式主要有：电激活和化学激活,显微操作法进行细胞核移植,克隆羊成功的分子细胞生物学机理：,供体核DNA中有来源于乳腺细胞细胞质的调节蛋白，它阻止了核基因的表达。 重组卵细胞，基因的转录没开始，无调节蛋白 重组移核细胞丢失了源于乳腺细胞的调节蛋白。经过三次分裂后，原乳腺细胞的调节蛋白便全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了， 因此核DNA被重新编排，细胞开始表达自己的基因。,体细胞克隆成功
23、的意义：,1、证明了高度分化的细胞也可以回复到类似受 精卵时期的功能。,2、证明了细胞质具有调控细胞核发育的作用。,应用：,为遗传疾病的治疗、优良品种的培育等提供了重要途径；对濒危动物的保存也有重要意义。,克隆成功的条件（必备的基础）P20,1、具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞。(如乳腺上皮细胞)2、能有效调控细胞核发育的细胞质物质。（如去核的卵的细胞质）3、完成胚胎发育的必要的环境条件。（如诱导核-质重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境）,思考题,1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？,、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？,、为何动物细胞培养过程将组织分散成
24、单个细胞的呢？,、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？,、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？,没有,是,成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖,先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理,胰蛋白酶水解蛋白质,细胞间的成份是蛋白质,思考题,、细胞膜的主要成份是什么？,、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？,、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？,、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？,、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？,蛋白质和磷脂,能,注意时间的控制,不能，因为两的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰
25、蛋白酶的最适PH较接近,胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛,思考题,11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？,12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？,13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？,易于培养细胞贴壁，进行生长增殖,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。,将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。,这样的过程叫做传代培养,思考题,14、如何理解原代培养和传代培养？,15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？,16、有些为何能一直传下去吗？,17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？,18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？,上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养,不都能,发生突变，朝着癌细胞方向发展,不是,保存10代以内的细胞，因为1050部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展,
