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1、转基因动物及克隆动物,Transgenic Animal and Clonal Animal,内 容,转基因动物,克隆动物,概述、方法、应用,体细胞克隆,第一部分 转基因动物,1974年Jaenisch等用病毒SV40转化的小鼠早期胚胎移植到小鼠的子宫内，在小鼠的后代中检测到SV40基因的存在，进行转基因技术尝试，这是最早有关动物转基因的报道。,1980年，Gordon等首次采用受精卵原核显微注射法，首次将疱疹病毒和SV40的DNA片段导入小鼠基因组，成功制作转基因小鼠，开创了转基因动物的新纪元。,一、研究概况,1982年 Palmiter-“超级巨鼠”华盛顿大学的Palmiter将大鼠的生长
2、激素基因注射到小鼠受精卵内,培育出体型明显大于正常小鼠的超级鼠,成果轰动一时。,转基因小鼠A生长速度要比普通小鼠B的生长速度平均快50%。,1982年 Palmiter“超级巨鼠”,重组质粒,鼠金属巯基蛋白启动子之后,大鼠生长激素基因置于小,Plonucleus（雄原核）,显微注射,小鼠子宫,卵移植,SOUTHERN 杂交检测,超级巨鼠,1987年 世界上第一只商业化转基因 绵羊诞生(Roslin研究所)1989年 精子载体法应用于转基因动物1997年 转基因克隆动物(Roslin研究所)转基因克隆羊Polly:携带有人凝血 因子 1999年 上海遗传研究所宣布转基因试 管牛“滔滔”诞生,三十
3、几年里，转基因动物技术飞速发展，转基因兔、转基因猪、转基因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续育成。转基因动物技术已广泛应用于生物学、医学、药学、畜牧学等研究领域,转基因鼠,5只克隆出的转基因小猪Noel、Angel、Star、Joy和Mary。,全球首只转基因猴“Andy”,转基因鱼,转基因试管牛“滔滔”,英国19902000年科研中使用转基因动物的比例图,三十年来，转基因动物经历了 兴起高潮现在相对平稳的过程。其重要意义在于人为实现动物物种之间，甚至动物与植物、微生物之间遗传物质的交换与重组。如：改变动物性状 导入抗病基因,二、转基因动物的概念,转基因动物（Transgenic animal）,嵌
4、合体动物（Chimeric animal）,指染色体基因组中整合有外源基并能稳定遗传给后代的一类动物,部分组织细胞中整合有外源基因组的动物,三、转基因动物培育原理,四、方 法,显微注射法逆转录病毒法ES（胚胎干细胞）法,精子载体法,脂质体载体法,电脉冲法,基因枪法,体细胞核移植技术（转基因克隆技术）,（一）显微注射法（以培育转基因小鼠为例）,1.方法,显微注射制作转基因动物流程图,2.具体步骤,（1）前期准备实验动物：供体鼠、受体鼠、结扎雄鼠仪器设备：拉针仪、煅针仪、体视镜、显微注射仪实验试剂耗材：超排激素：PMSG、HCG、透 明质酸酶（HE）、小鼠胚胎操作和培养液：M2、M16、注射用矿物
5、油、注射针、持卵针,显微注射仪,拉针仪,煅针仪,体视镜,（2）受精卵的采集,供体鼠超排：PMSG,ip HCG,ip 48hr,输卵管膨大部受精卵的采集,受精卵消化、洗涤、培养,受精卵的采集,受精卵的消化、培养,消化、洗涤后受精卵,原核清晰的受精卵,注射前,注射后,（3）受精卵的显微注射,注射中,（4）受精卵的移植,受体假孕鼠的制备：母鼠与结扎公鼠合笼（与供体鼠同步）,假孕鼠的挑选,注射后收集卵的移植,受精卵的移植,（5）得到founder转基因小鼠（6）对founder转基因小鼠进行鉴定、筛选、杂交获得纯合转基因小鼠,（二）逆转录病毒法,关于逆转录病毒,1、Retrovirus是只有一条单链
6、RNA的病毒类的总称。2、逆转录病毒在逆转录酶（RT）的作用下可以将本身的单链RNA作为模板进行复制和遗传信息的传递。3、逆转录病毒通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞。,原 理,1、逆转录病毒具有高效感染和在宿主细胞DNA上高度整合的特性。2、逆转录病毒能作为目的基因载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生嵌合体动物，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。,关键步骤,（1）逆转录病毒载体的构建提取病毒DNA将DNA克隆载体中酶切病毒结构蛋白编码区将外源目的基因克隆到载体转染细胞，测定外源基因的表达。,（2）包装细胞 决定着重组病毒效价及其宿主范围。常用-2细胞株（3
7、）重组逆转录病毒感染早期胚胎 载体转染包装细胞后与8细胞胚胎共培养进行转染（4）胚胎移植（5）建系,（三）胚胎干细胞介导法（ES细胞法）,关于ES细胞,1、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）人或动物的胚胎中均存在一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的干细胞，称胚胎干细胞。2、它与早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能参与宿主胚胎的发育，形成包括生殖细胞在内的所有组织。,原 理,将外源目的基因导入ES细胞，再移入胚泡期的宿主胚胎，最后将宿主胚胎移植到假孕母鼠子宫内，便可获得由胚胎干细胞介导的转基因动物。,关键步骤,ES细胞的分离培养ES细胞基因操作 电穿孔、显微注射、
8、磷酸钙-DNA共沉淀、逆转录病毒感染等方法 获取囊胚期胚胎显微操作 ES细胞注射到囊胚期胚胎内 胚胎移植,三种转基因方法优缺点比较,优点：1、整合率相对较高2、可导入基因片断较长3、外源基因整合于所有的组织细胞中的概率高 缺点：1、整合率随机2、有些动物原核看不清，需经特殊处理才能有效导入3、需较精密仪器，费用昂贵,显微注射法,优点：1、胚胎存活率高2、病毒DNA随机单拷贝整合3、宿主范围广 缺点：1、整合率不高，整合位点是随机的2、后代多为嵌合体动物3、外源基因易发生重排或丢失4、病毒载体容量不大5、病毒DNA序列可能会干扰外源基因的表达,逆转录病毒法,优点：1、整合率可控2、可用多种方法将
9、外源基因导入ES细胞，其细胞的鉴定和筛选比较方便3、ES细胞注入囊胚及囊胚移植到子宫，操作比较简便 缺点：1、ES细胞系培养、保存和维持不易2、后代多为嵌合体3、所需时间较长,ES细胞法,五、转基因关键技术,外源目的基因的制备外源目的基因的有效导入受精卵（胚胎）培养与移植外源目的基因表达的检测等,六、应用价值,研究基因的结构和功能及其表达与调控建立人类疾病动物模型 研究人类疾病基因治疗 研制生物反应器扩大移植供体来源 改良动物品种,1、研究基因的结构和功能及其表达与调控,Gene knockout(基因敲除)：是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序
10、相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。,2、动物疾病模型,200多种动物模型建立（病毒、遗传、肿癌及眼疾病等）800余种人为改造小鼠产生,其中开发最成功的是转基因小鼠,HBV转基因动物树鼩,3.基因治疗（gene therapy）,指将外源功能性目的基因导入病人体内，通过调控目的基因表达，抑制、替代或补偿缺陷基因，从而恢复受累细胞、组织或器官的生理功能，达到疾病治疗目的的一种方法。,转基因动物为人类疾病基因治疗 提供了良好的实验依据和模型,4、研制生物反应器,生物反应器：将药用蛋白或具有特殊意义的蛋白质基因导入动物的受精卵或早期胚胎，培育成转基因动物，使之在动物体内（如乳腺
11、、血液等）高效表达，生产出天然活性蛋白，这种转基因动物就称之为动物生物反应器,优势,目标产品产量高，容易收获目标产品质量好生产成本相对较低目标产品的提取相对较容易,主要动物,牛、羊、猪、鸡,主要靶器容,乳腺、血液系统、膀胱 及鸡输卵管系统,用动物乳腺表达外源基因的主要种类产品类别 举 例 血液产品 第8因子、第9因子、C蛋白、凝血酶III、抗胰蛋白酶、血纤蛋白原抗体 单克隆抗体药物 干扰素、人生长激素、tPA、EPO疫苗 Malaria组织维生物 Collagen营养药 乳白蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶、人源化牛奶工业蛋白质 蜘蛛网蛋白、贝类分泌的黏蛋白,我国乳腺生物反应器研究情况 目的基因名称 产
12、品的主要功能 承担单位 人血清白蛋白 血液溶胀剂 中国农业大学 人干扰素 抗病毒因子 中国农业大学鸡法氏囊病毒VP 鸡疫苗 中国农业大学 第九因子 血友病治疗 上海儿童医院 EPO 细胞因子 上海儿童医院 人胰岛素原 糖尿病治疗 新疆牧科院 TPA 治疗血栓 军事医学科学院 人生长激素 生长激素不足 扬州大学,现状,已有约10种基因在大动物上得到高表达（1g/L以上），其中抗胰蛋白酶、凝血酶和葡萄糖苷酶进入临床实验阶段。世界上只有少数几头转基因牛问世，还没有生产出具有商业价值的转基因牛。,难点,主要问题,研制时间长、技术复杂、投资过大、风险性高,转基因技术局限性基因调控机制,携带人血清白蛋白基
13、因的转基因牛“滔滔”,五、异种移植,猪的器官大小、解剖生理特点与人类相似，其组织相容性抗原与人有较高的同源性。“三关”超急性排斥 延缓性排斥、慢性排斥通过转基因来解决异种器官排斥的问题,英国：将人的CD55、CD59转入猪中，在 仔猪血管内皮细胞表达CD55、CD59。将此转基因猪的心脏移植给猴，存活 了10天。同济：将人的DFA转入猪中，此转基因猪 的心脏在猴体内存活了90小时,六、品种改良,生长相关基因 产毛性能相关基因 抗病毒相关基因,生长激素基因转基因猪：生长速度提高了1015%饲料报酬和瘦肉率提高了10%主要问题：该转基因猪传了7代，仍未生产出纯合的转基因家系。,七、主要设备,显微操
14、作仪,拉针仪,煅针仪,电融合仪,电 极 杯,细胞融合操作界面,CO2 培养箱,体视显微镜,评 述,小鼠模型成功率高 现转基因方法存在局限性，转基因率低 现有的理论和技术还不能使人们随心所欲操 作动物基因组 转基因动物仍具有商业化、产业化发展潜力,第二部分 克隆动物,克隆（Clone）,WHO:遗传上同一的机体或细胞系（株）的无性生殖。,克隆动物（clonal animal）,是指用人工方法得到无性繁殖的在遗传上与亲本动物完全相同的动物,动物克隆方法,一、胚胎分割,二、细胞核移植,胚胎细胞核移植 体细胞核移植,一、胚胎分割法,将未着床的早期胚胎经显微手术后，分割为二、四、六若干等份，给每个受体内
15、植入一部分胚胎而妊娠产仔，这样由一个胚胎可以克隆出多个遗传性能完全一样的后代个体。,原理,实质,多胞胎复制,二、核移植法（nuclear transfer）,（一）胚胎细胞核移植,把发育到后期的胚胎的细胞核取出通过显微操作移植到另一去核卵中发育出新个体,1、基本思路,2、操作程序(1)卵母细胞去核：吸管吸除法 紫外线照射法(2)核供体的准备和移植:单个卵裂球(3)卵裂球与卵子的融合:电融合法(4)卵子的激活：电脉冲法(5)克隆胚胎的培养和移植,3、存在问题 效率太低：克隆胚胎的成活率只有1020，成本太高,（二）体细胞核移植,1997年，Nature杂志发表了Roslin 研究所的Wilmut
16、等用乳腺细胞核移植培育 克隆绵羊“多莉(Dolly)”的实验报告，引起世人瞩目！,Wilmut and Dolly,什么是体细胞克隆？,将体细胞核移入去核的卵母细胞中，使卵母细胞被刺激、分裂并发育成个体，使得核供体的基因得到完全复制。,体细胞克隆的关键环节,体细胞克隆的主要程序与胚胎细胞克隆基本相同，其主要差别在供体细胞的选择血清饥饿法：在血清浓度从10降至0.5的培养液中培养5d诱导至静止期然后移入去核卵母细胞，恢复体细胞的全能性,技术线路图,划时代意义,理论上,证明了分化了的动物体细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化,证明了利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，
17、将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。,实践上,克隆动物与克隆技术的应用,1、培育遗传均一的实验动物,2、培育优良畜种和拯救濒危动物,3、制备转基因克隆动物,4、治疗性克隆（therapeutic cloning）,此外，克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的，它为研究配子和胚胎发生，细胞和组织分化，基因表达调控，核质互作等机理提供了工具,存在的问题,克隆技术在理论和技术上都还很不成熟。在实践中，克隆动物的成功率还很低。生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。,谢谢大家！,
