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1、转基因小鼠技术-转基因小鼠的构建,基因打靶的简易程序,优点：外源基因整合情况的可控性高可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便缺点：ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体,胚胎干细胞（ES细胞）法,主要是利用反转录病毒的长末端重复序列(LTR)区域具有转录启动子活性的特点,将外源基因连接到LTR下游进行基因重组后,再包装成为高滴度病毒颗粒,去直接感染受精卵或显微注入囊胚腔中,携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。,3、逆转录病毒感染法,3、逆转录病毒感染法,优点
2、由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA中的高度整合特性,大大提高基因转移的效率细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中扩增和表达。病毒载体是较理想的真核基因工程载体缺点获得纯合体的转基因动物的机会少病毒载体构建复杂转入的外源基因的大小受到限制,10kb转入病毒自身基因的复制表达,4、体细胞核移植法,首先将目标基因转移到体外培育的动物体细胞中,筛选出阳性转基因细胞并进行繁殖,制备出供移植用的细胞核供体。然后将转基因细胞核供体移植到去核的卵母细胞中,重构胚胎经过激活和培养后,移植到代孕小鼠中1997 年,英国Roslin 研究所的Wilmut等利用成年绵羊乳腺上皮细胞作为核供体,成功获
3、得了体细胞克隆绵羊多莉(Dolly),拉开了动物体细胞克隆技术的序幕。,显微法和克隆法效率比较,1997 Nature 385,810813,4、体细胞核移植法,优点减少受体动物的数目,不需要用受体母畜来承担那些非转基因的胚胎,表现了强大的生命力。事先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞进行筛选,简化了转基因动物生产的许多环节,节约了人力,具有很大的优越性。缺点体细胞克隆技术近年来发展势头十分迅猛,但在基础理论和实验技术上还需进一步探索。,4、体细胞核移植法,5、精子载体法,将精子与外源DNA进行预培养之后,使精子有能力携带外源基因进入卵中,受精后进行胚胎移植,这样产生的动物也会使外源基因得到表达
4、。精子携带DNA的途径外源DNA与精子共孵育电穿孔导入法脂质体转染法,优点基因转化方法简便,效率高动物育种不经过嵌合体,实验周期短缺点目的基因整合的随机性无法早期验证修饰事件成功率不高、效果不稳定,5、精子载体法,6、YAC法（人工酵母染色体法）,优点：克隆百万碱基对(Mbp)级的大片段外源DNA 的能力,可以保证巨大基因的完整性;保证所有顺式作用因子的完整并与结构基因的位置关系不变;保证较长的外源基因片段在转基因动物研究中整合率的提高;鉴于基因的完整性,目的基因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基因整合的位置效率。缺点：不稳定，制备工艺繁琐。,7、BAC法（人工细菌染色体法）,建立在大肠杆菌的F
5、因子上的BAC载体：外源DNA可300kb。F因子（F质粒）是一种“性质粒”，可转移至F-宿主细胞。100kb,近百个蛋白质。可构建BAC文库；有单一的loxp位点，利于图谱分析（借助标记loxp和cre 重组酶；BAC载体两端有Sp6和T7 引物序列利于测序，确定基因的 染色体定位；可稳定遗传，易于操作。BAC文库：基因组酶切后100300kbDNA+BAC大肠杆菌,基因转移方法的比较,Electroporation,电击仪,转基因小鼠技术-转基因小鼠在科研中的应用,1.7500万1.25亿年前-人鼠始祖,小鼠的历史,2.19世纪-宠物鼠-实验鼠的“先驱”,3.1897年-重组表型,4.19
6、00年-从宠物鼠到实验鼠,Abbie Lathrop-饲养宠物鼠1902年，William Ernest Castle购买老鼠，用于遗传学研究。哈佛大学-老鼠的毛色进行观察，以检测孟德尔法则的正确性。,小鼠的历史,5.1905年-孟德尔老鼠,通过对黄白相间的杂色鼠进行研究，法国遗传学家Lucien Claude Cuno 发现，两个携带黄色皮毛基因的老鼠之间交配，其子代老鼠中黄色老鼠和白色老鼠的数量比总是2:1。-这是报道的第一个等位纯合致死的基因。,Clarence Cook Little是一个来自于William Castle 实验室的哈佛大学生物学家，他培育出了第一个近亲繁殖的小鼠株系D
7、BA。,小鼠的历史,6.1909年-实验鼠的诞生,Clarence Little 和 Ernest Tyzzer 发现在同一株系小鼠间进行肿瘤移植不会产生排斥现象，但不同株系间的移植则会发生排斥反应。,7.1916年-肿瘤易受性和组织相容性,Jackson实验室的George Snell在1940年代发现了组织相容性基因-荣获了1980年的诺贝尔奖,8.1921年-C57BL株系,基因组测序在2002年完成,小鼠的历史,9.1929年-Jackson 实验室-世界上最重要的小鼠遗传学研究中心,在Hudson 汽车公司的头目Edsel Ford和Roscoe Jackson两位大财主的资助下，C
8、harence Little 在美国缅因州Bar Harbor 建立了Jackson 实验室,10.1953年-DNA双螺旋,Crick，Watson和Wilkins三人因为这项杰出的成就荣获了1962年的诺贝尔奖。,11.1966年-遗传密码破译,Robert Holly，Har Gobind Khorana 和 Marshall Nirenberg 破译了遗传密码-1968年的诺贝尔奖,小鼠的历史,12.1972年-小鼠遗传学的计算机数据库,Jackson 实验室设计了第一个哺乳动物遗传学计算机数据库,13.1977年-Sanger 测序法,和同事Walter Gilbert分享了1980
9、年的诺贝尔化学奖-人类和小鼠基因组测序过程中的主要技术,14.1982年-转基因小鼠,小鼠的历史,16.1987-89年-第一只基因敲除小鼠,Martin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 领导的几个研究小组-2001获得了Lasker奖,17.1996年-“百慕大法则”,公共基因组序列数据,18.1998年-克隆鼠,1997年克隆羊“多莉”诞生之后，夏威夷的一个小组培育出了第一批克隆鼠“Cumulina”和她的姐妹们。,15.1983年-PCR,Kary Mullis-1993年的诺贝尔奖,小鼠的历史,19.1999年-小鼠基因组测序协会,人类基因组
10、三个主要测序中心（The Wellcome Trust Sanger Institute,The Whitehead Center for Genome Research 和 Washington University Genome Sequencing Center）成立了一个相互协作的小鼠基因组测序机构，取名为小鼠基因组测序协会（Mouse Genome Sequencing Consortium,MGSC),20.2001年2月-人类基因组,21.2001年6月-散弹法,美国公司Celera Genomics 使用散弹法测得了用于销售的小鼠序列草图。散弹法是一种一次性测得基因组全序列的技
11、术。,小鼠的历史,22.2002年5月-16号染色体与已被分析的人类 21号染色体序列高度相似,23.2002年8月-小鼠基因组物理图谱,24.2002年12月-小鼠基因组,小鼠基因组测序协会发表了一份高质量的小鼠基因组序列草图，并且同时对C57BL/6J小鼠株系做了分析。这个基因组大小约为2.5Gb，比人类基因组要小，预计的基因也少于30000个。约有40%的小鼠和人类基因组序列相高度似性，80%的人类基因在小鼠基因组中能找到相应的基因。同时还有不少文章对小鼠遗传组成的其它方面做了详细讨论。在日本RIKEN 基因组科学实验室的努力下，很多相关的重要资源都能够被免费获取。,小鼠的历史,转基因小
12、鼠技术的应用,基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究基因工程定向育种转基因动物生物反应器研制 人类疾病小鼠模型与基因治疗药理学研究器官移植环境科学研究,基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究,Hox gene(同源异形盒基因）疾病基因学习与记忆基因生理周期基因,基因表达有时空与组织的特异性；外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；,基因工程定向育种,向动物体转移外源基因并使之在动物体内表达，能够克服物种间固有的生殖隔离，实现动物育种之间遗传物质的交换。实质是将基因转移与传统育种方法结合，各取其精华，快速创造新的目的变异和固定扩展变异，从而快速培育出高产优质和抗逆动物品种。转基因羊
13、、猪、鸡、鱼、鼠等,转基因动物生物反应器研制,转基因动物生物反应器概念：将具某种重要应用价值的生物活性蛋白基因导入动物受精卵或早期胚胎，培育转基因动物，使外源基因在动物的特定组织内高效表达，再从这些组织的分泌液、浸出液或血清中分离提取目的基因产物。乳腺-理想器官 肾脏和膀胱多肽药物、蛋白质疫苗、酶类,细菌-动物细胞-转基因动物,乳腺生物反应器具有以下特点：乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不回流到血液循 环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响；乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器；一头奶牛一年可生产乳蛋白250300Kg，一只绵羊或山羊一年可生产乳蛋白2530Kg。如果有百分之一的乳蛋
14、白代换成医用蛋白，产量十分可观。乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯。表达的蛋 白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性 接近天然产品；在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖 生产群体。,转基因动物生物反应器研制,转基因动物生物反应器研制,乳腺组织特异表的基因：具milk box保守序列-乳清蛋白基因-b乳球蛋白基因-酪蛋白基因已开发的产物：-血栓治疗药物（组织型纤溶酶原激活因子)-出血性疾病（凝血因子VIII，IX）-免疫治疗药物（IFN，IL，TNF）-营养制剂(人乳铁蛋白）,人类疾病小鼠模型与基因治疗,癌症-肺癌-p53功能缺陷遗传病-地中海贫血（临床失败-细胞
15、表达？）AD-对AD患者死亡后脑部解剖发现脑部存积了一种淀粉状蛋白-将人类淀粉状蛋白的基因转到大鼠体内使其发病，再清除淀粉状蛋白，发现能够减慢甚至停止病情,药理学研究,胰岛b细胞B7-1转基因小鼠对STZ敏感阿霉素抗癌，但心脏毒性等副作用大-金属硫蛋白MT具保护作用P糖蛋白-肿瘤多药耐药-knockout mice证实其影响药物的分布与清除,器官移植,超急性排斥反应补体激活的阻断-免疫抑制剂危险补体活性调节因子的负调控-膜辅助因子MCP-衰退促进因子hDAP/hCD591999-猪心猕猴（器官大小）,环境科学研究,生物可利用性的分析只能在活体研究毒理/环境基因组学转基因线虫-HSP16/lac
16、Z,转基因小鼠技术的主要问题,外源基因的整合率低外源基因的表达不理想成本高转基因给动物造成插入突变和机能紊乱转基因动物成活率低转基因动物产品的安全性,改善外源基因转移方法定点整合-cre/loxp组织特异性启动子生态/遗传/食品安全结合动物克隆技术-Dolly&Polly,参考文献,现代细胞分子生物学技术-科学出版社，林菊生主编精编分子生物学实验指南-科学出版社，颜子颖/王海林译小鼠胚胎操作实验手册-化学工业出版社，孙青原/陈大元译基因工程小鼠-上海科学技术出版社，傅继梁主编Transgenic mouse-methods and protocols-MH Hofker&Jan van Deu
17、rsen,参考文献,（Jackson lab，小鼠基因组资料库）(细胞信号同盟）Palmiter RD,et al.,Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes.Nature,1982,300(5893):611Gu H,et al.,Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-Loxp-mediated gene targeting.Cell,1993,73(6):1155,作 业,近五年英文文章一篇 集中于转基因小鼠的制作、解析及相关疾病的研究学习笔记（1000-2000字）解决问题选用方法结果分析研究意义总体评价（从立题、实验设计、结果分析及实际意义）,谢谢大家的配合,
