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1、第9章 转基因动物与动物生物反应器,1 转基因动物的培育技术2 转基因动物的应用3 动物乳腺生物反应器,转基因动物,基因工程技术胚胎工程技术转基因动物（transgenic animal）是指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。,转基因动物,转基因动物的命名,原代转基因动物:founder G0 G1 G2拟人化命名,1982年,Palmiter生产超级小鼠世界上第一只转基因动物:转入了生长激素基因的巨鼠（supermouse）,第一节：转基因动物的培育,1 目标基因克隆和体外重组 2 外源基因的导入
2、3 外源DNA整合、转录及表达的分子检测 4 转基因动物品系或品种的建立,外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系,转基因动物技术路线,哺乳动物生殖生理,哺乳动物受精和妊娠，整个过程都在母畜体内进。,一 转基因哺乳动物的制备方法,显微注射法逆转录病毒载体感染胚胎干细胞介导法精子载体介导法YAC介导的基因转移,1 显微注射法,雄性原核,受精卵,显微注射,胚胎移植,后定检测,显微注射法操作流程,a、转移率较高、整合效率达30%；b、外源基因长度可达50Kb；c、方法简单，导入
3、过程直观；,显微注射法的优点,a、设备昂贵、操作复杂；b、随机整合、首尾相连的多拷贝；c、常造成插入位点附近宿主DNA大片段缺失、重组等突变，出现动物严重生理缺陷；d、外源基因能否稳定整合要到子一代中筛选得到。,缺 点,2逆转录病毒载体感染法,原理：当逆转录病毒的RNA 进入细胞后，逆转录成DNA，依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异的核苷酸序列，转录出的DNA可整合到染色体上，从而将其所携带的外源基因插入到染色体上。,逆转录病毒载体,逆转录病毒感染法特点 优点：在各种转基因方法中，逆转录病毒感染法的转基因效率是最高的，且为单拷贝整合。缺点：逆转录病毒载体在设计时虽然缺失了病毒的复制功能序列，但
4、是复制大量载体DNA所需的辅助病毒基因组内有可能与目的基因一起整合到同一细胞核中，就可能大量复制病毒，造成严重的污染，故不安全。此外，逆转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA（10kb），而且逆转录病毒长末端重复的甲基化状态常使转基因的表达缺失。,3 胚胎干细胞法,胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。,它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。,胚胎干细胞法建立转基因鼠的实验程序,与传统育种方法相比较，ES细胞在生产转基因动物
5、方面表现其独特的优势：,（1）打破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制，加快了动物群体遗传变异程度；（2）可以进行定向变异和育种，利用同源重组技术对ES细胞进行遗传操作，通过细胞核移植生产遗传修饰性动物，有可能创造新的物种；（3）利用ES细胞技术，可在细胞水平对胚胎进行早期选择，这样可以提高选择的准确性，缩短育种时间。近年来的研究表明，利用ES细胞生产转基因动物在动物生产中发挥着极为重要的作用。,4 精子载体法,直接用精子作为外源DNA载体的转移方法。主要问题：重复性不好,精子与外源DNA结合的机理,精子直接与外源DNA混合培养，外源基因可以直接进入精子头部，受精后就可发育成转基因动物。后来Ro
6、ttman对此方法进行了改进，将外源DNA在与精子共孵育之前用脂质体包埋，使脂质体与DNA相互作用形成脂质体DNA复合物。这种复合体比较容易和精子细胞融合，从而进入细胞内。,5 YAC介导的基因转移,酵母人工染色体（YAC）载体是近年来发展的新型载体，具有克隆百万碱基对的大片段外源DNA能力。流程：ES转染YAC后体外筛选阳性ES细胞囊胚腔注射，或YAC原核微注射突出的优点：保证大片段基因的完整性,6 细胞核移植技术,将体细胞移植技术(克隆动物)与转基因技术结合，使转基因的群体能迅速被克隆扩大，还能保证目的基因在克隆后代中的稳定表达。优点：后代100%全是转基因个体，可以选择后代性别，转基因后
7、代遗传背景和稳定性一致，不需选配，节省时间和费用。缺点：难度大，成功率低、胎儿成活率不高,第二节：转基因动物的应用,（1）动物品种改良；（2）生物制药(乳腺生物反应器)；（3）建立人类疾病的动物模型；（4）生产可移植用的动物器官；（5）基因治疗(动物模型)；（6）基因打靶。,（1）动物品种改良,抗病育种生长性状,（2）生物制药(乳腺生物反应器),如荷兰的GenPharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元。,（3）建立人类疾病的动物模型,已建立的部分人类疾病的转基因动物模型_疾病模型 基因转移方法 转导的基因_老年性痴呆征 显微注射 淀粉样蛋白基因型糖
8、尿病 显微注射 胰岛淀粉样多肽基因地中海贫血症 显微注射 人珠蛋白基因镰刀形细胞贫血症 显微注射 人和珠蛋白基因唐氏综合症 显微注射 Cu/Zn-SOD酶基因卡氏肉瘤 反转录病毒转染 HIV tat基因成骨不全症 显微注射 突变的1胶原蛋白前体基因自毁容貌症 ES细胞同源重组 突变HGPRT基因_,4）生产可移植用的动物器官,我国每年有150万人需要器官移植，但是仅仅不到1万人能够得到供体。猪的脏器移植给人，会发生超急性排斥反应。转基因技术生产能降低排斥反应的转基因猪。,Science(2002).295,10891092,（5）基因治疗,上世纪九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脱氨酶)基因缺陷
9、导致严重免疫缺损的四岁女孩，由美国国立卫生研究院用ADA基因治愈。“基因治疗”研究热从此波及全世界，起而效颦，为保障人类健康展现了美好的前景。,（6）基因打靶,基因打靶(Gene targeting)是一种在胚胎干细胞(ES)技术和同源重组技术的基础之上,定向改变生物活体遗传信息的实验手段。基因整合三种方式：基因随机插入基因敲除基因替换,基因打靶,基因打靶的研究意义,基因功能研究人类疾病动物模型的研制经济动物遗传物质的改良,胚胎干细胞介导的基因打靶技术,首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。通过显微注射将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰
10、的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。,基因敲除的基本程序,打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种,基因打靶流程,应用举例：肌肉生长抑制素基因 Myostatin基因敲除,Myostatin基因是一种特异性骨骼肌生长发育的抑制因子。该基因与动物骨骼肌总量的调节有关，其序列在进化过程中高度保守，所有哺乳动物和鸟类均有很高的同源性。Myostatin基因在功能上也是非常保守的，其功能的缺失会造成可导致肌肉异常肥大。,比利时蓝牛肌肉增加表型,皮埃蒙特牛肌肉增加表型,M
11、yostatin基因敲除“超级鼠”,美培育转基因鳟鱼：腹肌有6块,肉多15%,2007年生理学或医学奖诺贝尔奖,美国犹他大学Eccles 人类遗传学研究所科学家Mario R.Capecchi、美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院教授Oliver Smithies 与英国科学家卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院Martin J.Evans因胚胎干细胞和基因打靶研究获得此奖项。,第三节：动物乳腺生物反应器,一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官
12、要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。,1987年美国科学家戈登（Gordon）等人首次在小鼠的奶中生产出一种医用蛋白tPA（组织型纤溶酶原激活物），展示了用动物乳腺生产高附加值产品的可能性。利用动物乳腺生产高价值产品的方式称为乳腺生物反应器。,1.动物乳腺生物反应器的制备,（1）表达载体的构建 目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元件，主要有四类乳腺定位表达调控元件：第一类是B2乳球蛋白(BL G)，第二类是酪蛋白基因调控序列：第三类是乳清酸蛋白
13、(WAP)基因调控序列；第四类是乳清白蛋白基因调控序列。,（2）目的基因的选择 选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表达量低、应用前景广阔的蛋白基因。,（3）体外重组 选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构建融合基因。,（4）基因转导 将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵。,（5）胚胎移植 利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待孕母体子宫内，生产转基因动物，得到转基因乳腺表达个体。通过采集转基因动物的乳汁,来获得目的基因表达产物。,（6）鉴定 转基因动物乳腺生物反应器可以从分子水平和乳腺分泌物两个方面进行鉴定。,2.动物乳腺生
14、物反应器的优点,产品质量稳定产品成本低研制开发周期短无污染经济效益显著,3.动物乳腺生物反应器的应用,高乳汁营养价值生产药用蛋白,患有庞普病的婴儿体内一种可促进糖原质代谢的酶有缺陷。荷兰研究人员培育出一种转基因兔，兔奶中表达这种酶，因此饮用这种奶可以治疗这种疾病。,4.动物乳腺生物反应器存在的问题（1）外源基因在动物体内的位点整合问题（2）乳蛋白基因表达组织特异性问题（3）目的蛋白的翻译后修饰问题（4）转基因表达产物的分离和纯化问题（5）转基因的技术与方法问题（6）伦理道德问题,前 景,转基因动物制药（乳腺生物反应器）是21世纪生物医药产业的一种新的药物生产模式。美国红十字会预测：到2010年
15、，转基因动物生产的商品将达到350 亿美元的销售额，生产的药物将占整个基因工程药物的90%以上。,研究展望,转基因技术是近年发展很迅速的一项新技术，尚有许多问题存在，有待进一步完善，但是该技术在医学和药学等领域有着广阔的应用前景，相信转基因动物研究将极大的推动医药科学的发展。,携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛“滔滔”,著名科学家谈家桢院士（左）、著名老中医徐蔚霖教授与曾溢滔院士在转基因牛“滔滔”模型前留影,Korea：Production of transgenic cloned pigs,transgenic cloned pigs with the green fluorescent protein(GFP)on June 8,2003.,转基因鸡,美国公司研制出可当宠物出售的转基因荧光鱼,转基因花菜棉羊,鸡冠花公鸡头变异,小老鼠猕猴桃绿色血,思考题,简介转基因哺乳动物的制备方法简介转基因动物技术的应用,
