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1、抗体的纯化和检测,by第四小组,抗体的纯化抗体的检测-ELISA,抗体的纯化 - 杨成遇 甘志雪,纯化步骤,抗体 纯化的步骤,一 饱和硫酸铵沉淀法,饱和硫酸氨沉淀是从溶液中分离蛋白质的常用方法。这是一种比较原始，非特异性分离技术。 饱和硫酸氨沉淀法难以得到高纯度的抗体。其它大分子蛋白和混入絮状沉淀中的蛋白会造成对抗体的污染。因此把它作为抗体纯化的第一步。,1，基本原理,高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示
2、。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。,2， 操作步骤,以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% 50% （一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ） 1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液（ 4.1 mol/L, 25 C ）.。2.其它不同饱和度铵溶液的配制 。,（二）沉淀 1.样品（如腹水） 20 000 g 离心 30 min ，除去细胞碎片；
3、2.保留上清液并测量体积； 3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为 1 ： 1 4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4 C ），使蛋白质充分沉淀。,（三）透析1.蛋白质溶液 10 000 g 离心 30 min （ 4 C ）。弃上清保留沉淀； 2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时（ 4 C ），每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。,Protein A/G亲和层析 亲和层析是一种
4、快速有效的生物活性物质的纯化方法,它通过偶联蛋白对目的蛋白选择性的吸收和分离,可取得较高的纯化效果,且操作简便,广泛地应用于实验室抗体纯化。由于产品价格昂贵,使用成本较高,限制了它的运用,Protein A A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上清中的单克隆抗体,Pro
5、tein G G蛋白是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白，一种三型Fc受体。其通过类似于A蛋白的非免疫机制与抗体的Fc段结合。像A蛋白一样，G蛋白与IgG 的Fc 区域特异性结合，不同的是，Protein G Sepharose 还可以特异性低亲和地与重链的CH1及轻链的C 结合而用于纯化Fab 及F(ab)2。另外，ProteinG可以广泛、更强地结合许多类型的IgG，多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配体脱落也相对更低。,Protein A-Sep harose CL2-4B 亲和层析柱分离提纯IgG,Protein A-Sepharose CL24B 亲和层析法的
6、原理是,A 蛋白可与IgG上的Fc 段特异性地结合,与小鼠IgG的各亚类表现为不同的结合力,结合的强弱程度依次是: IgG2a IgG2b IgG3 IgG1 。A 蛋白的这种结合也是具有p H 依赖性的,即可利用改变p H 及离子强度,纯化与其结合较弱的IgG1。,方法,腹水的处理取腹水,在4 ,12 000g 条件下离心15min ,以除去较大的凝块。装柱将1. 5g Protein A-Sep harose CL-4B 干粉用67ml 三蒸水溶解,再用0. 02M ,p H 7. 4 的磷酸盐缓冲液(上样缓冲液) 浸泡15min ,然后装入层析柱中。平衡用10 倍柱床体积的上样缓冲液过柱
7、,流速为1ml/ min , p H 试纸测试流出液体的p H 为7. 4 。,上样取预处理过的腹水5ml ,用上样缓冲液稀释至50ml ,用0. 45m 的滤膜过滤,上样,流速为1ml/ min 。洗脱用上样缓冲液进行流洗,10 倍柱床体积,流速为1ml/ min 。随后用0. 02M ,p H 4. 0 的柠檬酸缓冲液洗脱抗体,同时应用A KTA explorer100 进行监测,当观察到基线开始上升,即出现洗脱峰时,取干净的4ml 离心管收集,每收集3ml 后,立即用1M ,p H 9. 0 的TRis2Hcl 缓冲液调整p H 值至7. 0 。,平衡收集洗脱液至洗脱峰回到基线后,继续用
8、上样缓冲液平衡510 倍柱床体积,流速调至1ml/min 。再用三蒸水平衡10 倍柱床体积。7 电泳鉴定 采用SDS 不连续丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PA GE) ,浓缩胶和分离胶浓度分别为120g/ L 和50g/ L ,每槽加样10l ,考马斯亮蓝R250 染色。,层析图及电泳结果,MabSelect 系列大规模抗体纯化亲和层析介质,MabSelect 是一系列最新的大规模纯化抗体的亲和层析介质。它们的特点包括：更高的流速和动态载量 更低的宿主杂蛋白吸附，抗体纯度更高更低的蛋白A脱落更易于工艺的线性放大MabSelect易于清洗与除菌，寿命更长、更经济生产过程无动物血清成分,精度纯化,目的
9、：保证最终抗体产品纯度，能有效对潜在的污染物，如宿主细胞蛋白 (HCP)、免疫球蛋白、宿主DNA；对用于腹水生产抗体的刺激物、内毒素、其它热原物质、培养液成分、层析凝胶析出成分 (脱落的蛋白A配基) 进行去除；并能有效的去除/灭活病毒。,建议的工艺,首先采用0.2-0.45 m的中空纤维膜技术进行澄清 (Cell removal)；然后用protein-A或protein-B捕获，酸性条件洗脱后直接pH 4.0病毒灭活；澄清过滤后再穿透方式上Capto Adhere；这一步离子交换之前或之后会有一步20nm纳滤去病毒；最后50K膜超滤浓缩和洗滤进行缓冲液置换。有些抗体如果通过优化结果不甚满意，
10、通过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求,中空纤维膜技术进行澄清,对于动物细胞培养液，可以将高密度的培养液直接用中空纤维微滤膜 (0.22或0.45m) 进行澄清，而无需事先经过离心和预过滤，步骤少，速度快，收率高，成本低。和离心机比较，具有极高的澄清度，因此中空纤维澄清后的细胞培养液可直接进蛋白A亲和层析进行纯化。,层析精细纯化技术：,目的：去除特定的杂质，如HCP、DNA、聚集体和变体等。常用的层析技术：CaptoAdhere、离子交换、疏水层析等。,CaptoAdhere,目的：使抗体分子流穿而聚集体、宿主蛋白、脱落的蛋白A配基等杂质结合在Adhere柱上加以去除去。原理：Capt
11、o Adhere介质专为治疗用抗体的分离纯化而设计，其配基 (N-Benzyl-N-methylethanolamine）综合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方式，因此对于抗体的聚集体具有非常独特而高效的去除能力；此外，通过有效的实验设计 (Design of Experiment，DoE)，Capto Adhere介质还可以同时有效去除泄漏的蛋白A配基、宿主蛋白、核酸、内毒素和潜在的病毒，并使得结合MabSelect SuRe的抗体的两步层析纯化工艺成为现实步骤：首先，需要优化抗体在Capto Adhere上的结合条件。（确定的主要影响因素和实验设计范围为：电导：2-15mS/cm，
12、每毫升凝胶上样载量为75-300mg/ml (流穿模式)，pH范围需要做起始结合条件确定：通常在低电导条件下 (如2mS/cm时) 样品完全不结合到有少量样品结合的pH条件）,CaptoAdhere,其次（HTPD Predictor）：确定好实验条件后，可以同时平行做所有不同的结合条件，将试验结果相应于响应因子进行统计学分析 合并分析结果可以得到满足实验目标的操作范围。结果和优势：流穿模式的Capto Adhere将宿主蛋白、脱落的蛋白A和聚集体降低到很低的水平，载量可达100-200mg/ml介质，单步收率90%。此外，Capto Adhere还具有很强的病毒去除的能力，如MVM病毒的去除
13、能力可达5.9个Log。,将Mabselect SuRe和Capto Adhere相结合进行两步层析纯化。Mabselect SuRe可以达到99%的抗体纯度，亲和洗脱峰使用Capto adhere的流穿模式进行精纯: 使抗体分子流穿而聚集体、宿主蛋白、脱落的蛋白A配基等杂质结合在Adhere柱上加以去除。这样仅用两步层析就可以得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品，大大缩短了工艺时间，提高生产效率，同时增加了收率，降低了生产成本。,两步层析工艺,完善工艺整合中的其它问题,1， 核酸和内毒素的去除。2， 脱落亲和配基 (蛋白A) 的去除。a,阴离子交换层析是去除蛋白A-IgG复合物。b,阳离子
14、交换层析也可以去除蛋白A配基 。3,抗体制品的病毒去除/灭活及验证。低pH孵育、加热、S/D (溶剂/去污剂)、纳滤等,1， 核酸和内毒素的去除。,2， 脱落亲和配基 (蛋白A) 的去除。a,阴离子交换层析是去除蛋白A-IgG复合物。b,阳离子交换层析也可以去除蛋白A配基 。3,抗体制品的病毒去除/灭活及验证。低pH孵育、加热、S/D (溶剂/去污剂)、纳滤等,特异杂质含量验证,DNA含量：DNA分子杂交法测定。（100pg/一剂量）热原（内毒素）：家兔法等试剂。（5EU/Kg）病毒含量：Scale-down。（工艺除病毒能力需达到10log以上）,单克隆抗体的浓缩,目的方法：冻融浓缩法原理：
15、冻融处理后的样品，其溶质集中在浓缩管的下端，越近管底浓度越高,ELISA,- 徐顺 胡坚 李静一,1.ELISA的原理2.ELISA的类型3.试剂准备：免疫吸附剂 结合物 酶底物的准备 4.对照设定5.标本的采取和保存6.结果判断,ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 是一种免疫测定试验 。基础: 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。,1.ELISA的原理,酶免疫测定类型,这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定，
16、简称ELISA。,1.1抗原抗体反应,1.1.1可逆性,抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+AbAgAb,抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=AgAbAgAb ,AgAb的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。,1.1.2特异性,抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。,1.1.3最适比例,1.1.4敏感性,化学比色法的敏感度
17、为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。,2.1 双抗原夹心法测抗体,用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。,2ELISA的类型,2.2 间接法测抗体,传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。,2.3 竞争法测抗
18、体,当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。,2.4 捕获包被法测抗体,IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。,3. ELISA的试剂(A、B、C三部分),ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液,E
19、LISA的试剂准备A,固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。,3.1.2 包被的方式,将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基
20、团，故更易吸附到固相载体表面。,3.1.3 包被用抗体,IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。,3.1.4包被的条件,H9.6碳酸盐缓冲液pH7.2的磷酸盐缓冲液pH7-8的Tris-HCL缓冲液。 加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜，37中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质
21、的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。,3.1.5 封闭,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。 所有的ELISA固相均需封闭？,3.1.6 洗涤液在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。,ELISA的试剂准备B,3.2 结合物,即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂 1 酶的催化活性 2抗体（或抗原）的免疫活性
22、3含有或少含有游离的抗体（或抗原） 4结合物尚要有良好的稳定性。,3.2.1 结合物用的抗原和抗体,制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。,3.2.2酶,纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。H
23、RP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。,3.2.3 结合物的制备,酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。,（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%-70%）和重复性好。 交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。（2）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成chiff氏碱而结合。简便有效.,结合物中混有的游离
24、酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。 制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。,3.2.4结合物的保存,酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠）。,3.2.5 结合物的稀释液,用于稀释高浓度的结合物以配成工
25、作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐温20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8保存期可达6个月。,试剂准备 C 酶的底物,3.3 酶的底物,3.3.1 HRP的底物,OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。,DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2为供氧体， H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。,E,TMB经HRP作用后共产物
26、显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。,AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。,3.5 酶反应
27、终止液常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。,4 对照设定,阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。,参考标准品,定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防
28、腐剂的缓冲液中.,阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。,5 标本的采取和保存,体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。以血清标本为例：血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，可能会增加非特异性显色。,加样:,在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。,基本操
29、作注意事项,保温,抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育？温育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。,洗涤,ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。,显色,显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因
30、素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。,比色,拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。 结果以光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。,6 结果判断,ROC曲线接收者操作特征（Receiver operating characteristic）,定性测定,滴度 （免疫效价）通过血清学方法能显示一定反应的抗体或抗血清的最高稀释倍数。如终点稀释度为1/100，滴度为100，血清的效价(每1ml的血清中抗体效价)为100抗体单位。,根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。,定量测定,ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。,ELISA的操作要点,严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证ELISA必要条件。,THE END,Thank you,
