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1、北京清大天一科技有限公司2010年10月,疫苗悬浮培养工艺和反应器生产线,主要内容,悬浮培养技术的应用及特点反应器的分类、结构、功能和选择悬浮培养工艺（分类、关键技术及选择）悬浮培养生产线的建立,悬浮培养技术,概念： 细胞悬浮培养技术是指细胞在生物反应器中自由悬浮于培养液内生长增殖的一种培养方法。 全悬浮细胞培养贴壁细胞微载体培养,第一部分 悬浮培养技术在生物制药中的应用及特点,悬浮培养技术在生物制药中的应用历史和现状,早在1962年，BHK21细胞经驯化实现悬浮培养，1965年已实现在不锈钢发酵罐中悬浮培养生产口蹄疫疫苗。1967年，开发了微载体并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞。20世
2、纪80/90年代，CHO细胞实现悬浮培养，治疗性抗体的发展极大地推动着生物反应器在生物制药行业中的应用。全球利用动物细胞表达生产的产品疫苗、抗体、重组蛋白药物等产品的年销售额占生物制药市场的70以上。,随着流加培养、灌注培养、个性化细胞培养基等动物细胞培养技术的发展，生物反应器的细胞培养规模也趋向大型化。2000年以后，全球生产型动物细胞培养反应器的总规模已超过200万升，几乎都是机械搅拌式反应器；随着细胞培养基技术的发展，不再使用不能放大的反应器。预计2011年全球生物制药行业的生物反应器使用率将达到85%。动物细胞培养反应器体积还在不断增大：生产规模最大达到20000L以上机械搅拌式反应器
3、，如：Amgen（美国）和Lonza（瑞士）：20000L；Genentech（美国）：25000L。,国外生物制药生产,人用疫苗： 20世纪80年代利用1000L的机械搅拌式反应器培养VERO细胞生产人用狂犬病疫苗和脊灰疫苗（Pasteur，法国）。 应用微载体悬浮培养技术生产流感疫苗的机械搅拌式生物反应器规模达到6000L（Baxter，美国）。动物疫苗： 20世纪70年代，开始有20005000L的机械搅拌式反应器应用于口蹄疫疫苗生产（Wellcome，英国）。治疗性抗体： 已进入大规模反应器培养动物细胞的生产阶段，生产规模最大达到25000L机械搅拌式反应器（Genentech，美国）
4、。,国外悬浮培养应用,Baxter公司Vero细胞流感疫苗生产线,20000升反应器，Lonza,10000升反应器，DSM,抗体生产Lonza、DSM,国内人用和兽用疫苗生产企业超过100家，目前应用反应器悬浮培养技术生产疫苗的仅4家。超过95%的疫苗企业生产仍然采用批量小、效率低、劳动强度大、占用场地多的转瓶机。细胞培养基是50年代开发的MEM、DMEM、199、PRMI1640等基础培养基，血清添加比例10左右，细胞生产效率低。 治疗性抗体研发和生产处于起步阶段，多数采用进口无血清培养基和生物反应器。,生物反应器在生物制药中的应用历史和现状 我国生物制药生产,人用疫苗： 采用生物反应器生
5、产疫苗的辽宁成大等3家：采用数十台14L-30L量级进口反应器。兽用疫苗： 金宇集团1200L、650L反应器（国产CLAVORUS）生产口蹄疫疫苗。 南京梅里亚（MERIAL） 300L引进技术和进口反应器生产法氏囊疫苗。 治疗性抗体： 1000升生物反应器生产线（进口）：北京百泰 3000升生物反应器生产线（进口）：上海中信国健,我国悬浮培养的应用,来自金宇保灵网站,悬浮培养技术在生物制药中的应用历史和现状 国产动物细胞生物反应器,2008年之前，国产动物细胞反应器规模停留在230L，为模仿国外的实验品，未能形成规模化产业。2008年，国产CLAVORUS120L、650L机械搅拌式动物细
6、胞培养反应器在疫苗行业中得到成功应用。2009年，CLAVORUS1200L反应器上市。清大天一大容量反应器在疫苗生产中的应用，为自主提升我国生物制药产业技术奠定了基础。未来几年，生物反应器培养动物细胞的方式将逐渐成为我国生物制药产业的主流。,CLAVORUS反应器（位于清大天一工艺实验室）,左为CLAVORUS 650L反应器，右为CLAVORUS 120L反应器,采用悬浮培养技术生产疫苗的特点,优点自动化程度高，工艺条件稳定、可控，批量大、均一性好。无血清或低血清、无动物成分培养，不良反应小。提高劳动生产效率，减少劳动强度。减少生产场地需求，提高生产规模。节能低碳、降低成本。有利于申报疫苗
7、品种、文号。存在技术门槛、知识产权，有利于市场竞争。困难较高的技术门槛，缺乏支撑技术。对悬浮培养技术、包括产业化知识了解不足，技术人才缺乏。基本都是转瓶生产的老厂，需要车间技术改造，一次性资金投入大。,GMP车间运行的疫苗悬浮生产线 动物细胞培养反应器生产线疫苗悬浮生产工艺过程技术,1、动物细胞培养反应器生产线硬件基础 2、疫苗悬浮工艺技术（PROCESS DEVELOPMENT）软件基础,动物细胞,细胞和病毒生物反应器细胞培养基细胞培养工艺,生物制品生产核心要素,第二部分 核心设备生物反应器 （分类、结构、功能及选择）,生物反应器分类-根据反应器的几何特征,搅拌式生物反应器:（Stirred
8、 tank bioreactor） 通过搅拌器的作用使细胞和养分在培养液中均匀分布，如笼式通气搅拌器、双层笼式通气搅拌器、桨式搅拌器等。优点：用于悬浮细胞与微载体贴壁细胞培养提供均质环境培养工艺容易放大产品质量稳定、非常适合工厂化生产缺点：搅拌产生的剪切力,生物反应器分类根据反应器的几何特征,气升式生物反应器【Airlift bioreactor 】： 通过气体上升作用带动细胞和养分在培养液中均匀分布，常分为内循环式、外循环式、内外循环式。主要用于一些单抗生产。优点：均质的培养环境剪切力小容易放大缺点：气体上升对动物细胞的损伤大泡沫问题严重,生物反应器分类根据反应器的几何特征,填充床生物反应器
9、【packed bed】 ： 填充一定材质的填充物，细胞截留在填充物中生长。固定床和流化床等。优点：高细胞密度和产率缺点：培养环境不均质规模较难放大细胞难以计数,一次性反应器： Wave波浪式生物反应器、一次性搅拌生物反应器等。优点：能够高密度培养，使用方便。缺点：放大较难，适宜于实验室规模。工业化成本较高。,生物反应器分类根据反应器的几何特征,搅拌式生物反应器是在当前被FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产用主流设备。,生物反应器应用的发展国外,生物反应器应用的发展国外,辽宁成大,广州诺诚,金宇保灵,生物反应器应用国内,生物反应器的结构(搅拌式）,罐体支架管路控制器,反应器主要功能（搅拌
10、式）,清洁功能、无菌性（蒸汽灭菌）及密封性搅拌控制功能温度控制功能pH控制功能溶氧（DO）控制功能液位控制功能细胞截留功能,清洁功能：罐内壁和零部件材质要求，设计无死角密封性在线蒸汽灭菌,支撑管路（水、电、气）加热系统气体系统蒸汽系统,清洁功能、蒸汽灭菌及密封性,反应器功能,搅拌控制功能 搅拌组件分为顶部机械搅拌和底部磁力搅拌，底部磁力搅拌的搅拌叶轮与反应器形成一定夹角，带动料液转动产生涡流，实现料液充分混合。搅拌电机采用无级变速，运行平稳。对细胞培养效果的影响均匀搅拌以使培养液充分混合，保障营养供给并提高氧传递效果；由于动物细胞对搅拌剪切力敏感，应充分降低搅拌剪切力；机械搅拌轴应良好密封，避
11、免污染发生。,反应器功能,温度控制功能采用夹套进行温度控制，反应器温度由温度电极进行检测，夹套的加热或冷却，由控制程序自动控制。对细胞培养效果的影响 接种细胞以及更换培养液等过程需要快速升温；温度稳定性影响细胞生长。,夹套蒸汽加热电加热增压泵双温度探头,反应器功能,H控制功能使用pH电极进行检测，由控制程序自动控制酸、碱液的加入，实现pH控制 对细胞培养效果的影响 信号响应延时和控制灵敏性影响pH控制稳定性 pH电极和控制器质量影响控制效果，引起控制偏差,H电极pH控制器酸碱蠕动泵,反应器功能,溶氧控制功能使用溶氧电极进行检测，由控制程序自动控制各种气体的加入，实现溶氧的控制。对细胞培养效果的
12、影响信号响应延时和控制灵敏性影响溶氧控制稳定性溶氧电极和控制器质量影响控制效果，引起控制偏差,溶氧电极气体流量计电磁阀气动隔膜阀气体过滤器微泡分布器,反应器功能,液位控制功能使用反应器进行灌流培养时，为保持培养体积的恒定，需控制反应器培养的液位，可使用液位电极或称重模块来实现。称重控制优势任意更改培养控制体积，具有更大灵活性。精确检测及控制培养过程中的物料补充。并具有底搅拌电机重量保护功能，当液位低于重量保护设定值时，底搅拌电机不被开启。,称重模块料液蠕动泵,生物反应器的选择,满足动物细胞反应器培养的基本前提：清洁性、无菌性及密封性：无死角，易清洁，达到灭菌彻底、无菌要求及密封性要求，能够满足
13、工业化生产需要。混合均匀、剪切力小：满足传质、传热需要，同时对动物细胞伤害小。控制的可靠性、稳定性：疫苗生产工艺对生化参数非常敏感、生产线的稳定性及连续性等。,满足所生产疫苗品种特征、产能的需求反应器规模、放大配置、生产线数量、场地条件满足动物细胞培养和病毒培养工艺的具体要求搅拌浆叶、旋转过滤器等细胞截流装置配件的设计和选择与所需要培养的细胞工艺相匹配,生物反应器的选择,生物反应器的选择,标准化、配件提供及售后服务1、工艺接口标准化2、配件提供的速度 零部件的维修及更换时的期限；例如使用进口反应器，可能出现维修及零部件更换时间较长等。3、售后服务售后服务响应时间；维修配件订货周期；售后产品装置
14、、调试及操作培训；产品保修期内的维修；,第三部分 悬浮培养工艺过程技术,悬浮培养技术应用的过程技术,目标：提高细胞密度和单位细胞比生产效率，延长高 密度细胞的培养周期，从而提高生物反应器的生产效率。过程发展技术：培养方式的选择：批培养、灌流培养、流加培养生化环境的优化：温度、pH值、 DO溶氧、渗透压、CO2等。放大技术：全悬浮放大和微载体放大。 基于反应器培养工艺特点的个性化细胞培养基设计和应用：生长培养基、维持培养基、流加培养基培养基流加策略：流加速率代谢控制：减少细胞代谢副产物，提高产量。,细胞贴壁与否？可否驯化？可改造否？细胞全悬浮培养（CHO、BHK、杂交瘤细胞等）细胞微载体悬浮培养
15、（VERO、ST、Marc145、MDCK）,BHK21细胞,ST细胞,悬浮培养工艺,批培养流加（补料）培养灌流培养,批培养,流加（补料）培养,灌流培养,几种悬浮培养工艺（即生物反应器操作方式）,批培养,优点操作简单，直观反映细胞在生物反应器中的生长、代谢变化等特点。缺点但由于初始营养物比较丰富，造成细胞的过量利用，积累大量的代谢废产物，细胞的生长随着受到抑制，生长周期较短，培养基利用率低，细胞密度也不高。,特点： 具有操作简单、产率高、容易放大等优点。关键：1 培养基的优化2 流加策略的应用（过程控制）,特点：培养体积小，回收体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，利于保持产品
16、的活性等特点。不足：操作比较繁杂，培养基利用效率低，工艺放大过程困难。,流加培养,灌注培养,主流的悬浮培养生产工艺发展方向,当前被FDA批准的生物技术产品（重组蛋白和抗体为主）和公开发表的主流生产工艺 生物反应器：搅拌式生物反应器 细胞培养技术：反应器流加培养技术 个性化培养基：无血清培养基,选择反应器悬浮培养工艺需要考察的几个因素细胞和病毒的关系产物稳定性培养基或添加物的选择培养规模,不同的细胞培养和生产工艺不同，采用的培养方式不同对于分泌型且产品活性降低较快的生物制品，为保持产品的活性，宜采用灌注培养，并且灌注培养更适宜于微载体培养。同一生物制品由于其营养环境的不同，如无血清培养和有血清培
17、养，其生产工艺也可能发生变化：BHK21细胞生产口蹄疫，在有血清培养时采用批培养，接毒前需要更换无血清的维持液；而无血清培养整个过程中无需进行换液，但流加培养可能效果更好。,提高反应器悬浮培养工艺的生产效率,细胞株和病毒系过程发展（优化） 生化环境 流加策略 产品回收效率维持生物制品质量培养基设计（个性化培养基）,个性化细胞培养基最关键、最基础要素。,提高目标生物制品产物稳定性、产量、表达量需要个性化细胞培养基。如Lonza公司通过培养基优化提高表达率9.4倍。提高放大倍数，由于培养基的改进，每级放大倍数从8-10倍提高到16-20倍甚至更高。金宇保灵悬浮培养BHK21细胞实现5L100L放大
18、。,1985 2-5mg/L1990 20-100mg/L1995 50-500mg/L1998 501000mg/L2002 1002000mg/L2005 1005000mg/L,1，基因工程：载体、受体细胞（80ug/106cells/day）2，培养基设计：更适合细胞生长和蛋白表达3，工艺技术：流加培养、过程控制的精密化和自动化,抗体表达量的提高,进步的原因分析,一个技术发展的例子：抗体生产中的应用,个性化培养基是国际生物制药行业的普遍模式,细胞培养基的委托开发和委托生产服务是提高反应器生产效率的最直接、有效的手段。在国外生物制药企业被普遍采用，生物制药公司自行开发或与培养基公司合作开
19、发最适合自身细胞特点的个性化细胞培养基，合同委托培养基公司定制产品。,如某知名国际品牌定制的性化培养基占其培养基业务的90%以上，而在中国销售的却全是目录产品。 台湾的生物制药企业也需求定制无酚红的个性化细胞培养基。,细胞无血清悬浮培养技术,细胞无血清培养技术是未来生物制品生产的趋势由于动物血清提取的局限,给细胞培养带来标准化困难细胞培养表达产品分离纯化难潜在的病毒/支原体等污染全球化血清供应困难问题成本问题,具体情况具体分析是否必须使用无血清培养基，例如抗体药物、流感疫苗等要求必须使用。考虑产品成本，无血清培养基营养成分丰富、复杂，相对价格昂贵，在不是必须的条件下就要考虑成本问题。此外，还要
20、考虑纯化需求。 悬浮培养疫苗是否需要使用无血清培养基要视情况而定。,无血清培养基对于当前国内悬浮培养疫苗的必要性？,1200L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒技术650L反应器悬浮培养BHK21细胞生产兽用狂犬病毒技术120L/650L反应器微载体培养Marc145细胞生产蓝耳病毒技术120L反应器微载体培养ST细胞生产猪瘟病毒技术120L反应器微载体培养Vero细胞制备小反刍兽疫病毒技术120L反应器微载体培养Vero细胞制备人狂犬病病毒技术120L反应器微载体培养Vero细胞生产人甲肝病毒技术,国内疫苗悬浮培养生产技术,一：1200L反应器悬浮生产口蹄疫病毒技术,背景： 国内口蹄
21、疫布控形势仍严峻，高效、安全的病毒性疫苗是防止口蹄疫情发生的最有效方法。BHK21细胞是繁殖FMDV的理想宿主，国外普遍采用了20005000L反应器悬浮培养BHK21细胞技术生产口蹄疫苗（Intervet、Merial）。,Intervet公司 FMDV生产（荷兰）,1000L反应器细胞培养,病毒培养,1200L反应器生产FMDV工艺过程,BHK21悬浮培养基BHK21悬浮细胞的适应和筛选FMDV病毒的悬浮细胞适应BHK21种子细胞逐级放大DO、Temp、pH、过程放大、病毒接种等工艺参数。,悬浮培养BHK21细胞的生长,反应器中悬浮培养的BHK21细胞,细胞生长曲线,培养基： BHK21悬
22、浮细胞培养基细胞密度： 3-12106cells/ml,反应器悬浮培养BHK21细胞制备FMDV（5L120L 650L 1200L ）,健康BHK21细胞,接种FMDV后的BHK21细胞,650L的BHK21全悬浮培养生产线,1台120L反应器（种子BHK21细胞）,2台650L反应器（病毒繁殖）,5L反应器,1200L的BHK21全悬浮培养生产线,120L反应器（种子）,1200L反应器（病毒繁殖）,5L反应器,650L反应器（种子）,反应器无血清培养BHK21技术,疫苗安全性技术发展趋势,培养基 BHK21无血清细胞培养基最高细胞密度 5.6106cells/ml 活率94,无血清培养B
23、HK21接种FMDV后的病变情况,10hr after FMDV inoculated,15hr after FMDV inoculated,无血清和低血清悬浮培养BHK21细胞FMDV敏感性实验,实验方法 不同工艺条件下，BHK21细胞密度在1106cells/ml左右，接种相同FMDV病毒量，取样观察并计数。,无血清和低血清悬浮培养BHK21细胞FMDV敏感性实验,反应器无血清悬浮培养与转瓶培养BHK21细胞经济效益对比,BHK21细胞悬浮培养技术平台的应用,无血清悬浮培养BHK21细胞技术平台低血清悬浮培养BHK21细胞技术平台应用领域： 口蹄疫病毒（FMDV） 兽用狂犬病毒( Rabi
24、es Virus Flury株或ERA),。,二：120L/650L反应器培养ST细胞生产猪瘟病毒技术,反应器： CLAVORUS TM120L反应器微载体浓度：3g/L ，cytodex-1ST细胞密度(接毒时)：3106cells/ml病毒滴度：大于20万家兔感染量/ml。一批疫苗生产能力： 运行近一个月，收获 50万mL的病毒液，可制备1300万头份苗：50 (7500200000)=1300万(头份),反应器微载体培养ST细胞生产猪瘟病毒工艺流程,复苏ST细胞,配苗,培养基狂犬病毒的微载体悬浮细胞适应微载体的选择、用量放大过程中的消化控制及污染排除搅拌、DO、Temp、pH、细胞及病毒
25、接种等工艺参数。,接种24hr后的ST细胞,接毒前的ST细胞,维持培养25天的ST细胞,病毒液的电泳图,反应器微载体培养ST细胞生产猪瘟病毒过程,第3收上清,marker,种毒,反应器微载体悬浮培养生产线,120L,650L,10L,反应器微载体和转瓶培养Vero细胞狂犬病毒经济效益对比,第四部分-如何设计和建立疫苗悬浮培养生产线？,前提条件：1、悬浮培养生产线拟生产的疫苗品种 2、疫苗悬浮生产线的产能大小,设计反应器疫苗悬浮培养生产线的步骤,1、疫苗的品种决定了生产使用的细胞，如MARC145细胞、ST细胞、BHK21细胞、MDCK细胞、Vero细胞等。 疫苗生产通常选用相对成熟的病毒株和相
26、应宿主细胞。 2、根据细胞特点，选择全悬浮培养或微载体培养。 3、根据病毒和细胞的关系，确定反应器细胞培养和病毒培养操作方式，即批培养、间歇换液培养、灌注培养以及流加培养等。,4、根据疫苗年生产量（设计产能需要、疫苗生产周期、灭活苗或者弱毒苗）、反应器病毒生产效率等因素，确定一条生产线上的反应器规模以及生产线数量。 5、根据疫苗生产工艺的需求，选择合适的反应器和配套部件，尤其是工艺部件。比如，微载体培养工艺中的深层收液管、加液管等，消泡管道和补碱管道的不同选择；配件的供货速度、技术支持和价格等。6、建立起反应器疫苗生产工艺技术。其中，选择适合细胞生长及繁殖病毒的个性化细胞培养基或者病毒维持液，
27、是提高反应器病毒生产效率的重要手段。,设计反应器疫苗悬浮培养生产线的步骤,通用环境条件：地面、温度和湿度等洁净车间或者负压区，反应器生产工艺上需配有相应的纯化水、注射用水、冷却水、纯蒸汽、工业蒸汽、压缩空气、氧气、CO2等标准连接口等。220V、380V电源，建议反应器配有稳压器和USP不间断电源系统，特别是电网供电不稳定地区。培养基配液罐、培养基储罐、病毒收获液储存罐等辅助设施的个数、规模以及布局，可根据不同疫苗产品的工艺要求进行配置。面积和层高等要求 1条120L-650L 生产线的占地面积（10m215m2 ）： 层高：2.7-3m,7、场地和公用工程,设计反应器疫苗悬浮培养生产线的步骤
28、,反应器生产效率 细胞、病毒，根本是疫苗的品质和产量,反应器和转瓶比较法 1、细胞数量比较法 反应器全悬浮培养BHK21细胞，细胞密度可以达到3106cells/ml左右，1个650L反应器运行一批生产的细胞量相当于500750个15L转瓶的细胞数量。 2、病毒数量比较法 测量病毒滴度（LD50、TCID50、抗原定量）。,计算法 根据反应器生产工艺和病毒抗原生产效率，计算反应器效率。 反应器微载体培养ST细胞，密度可以达到3106cells/ml左右，收获的病毒上清大于20万家兔感染量/ml。猪瘟病毒是分泌性病毒，不产生CPE，可连续收获1个月左右。 1台120L反应器批生产能力： 50万m
29、L猪瘟病毒原液(20万家兔感染量/ml以上) 1300万头份苗： 50 (7500200000)=1300万(头份),生物反应器生产效率 细胞、病毒，根本是疫苗品质和产量,举例:设计1条年产2亿毫升猪瘟疫苗的反应器生产线,前提条件：猪瘟传代细胞苗，年产能2亿毫升步骤一：ST细胞步骤二：微载体培养步骤三：批培养灌注培养/间隙换液生产步骤四：确定生产线上反应器规模和生产线数量,10L反应器120L反应器650L反应器生产线,一条10L-120L-650L生产线，生产半年，即可满足产能需求。,10L-120L-650L疫苗悬浮生产线工艺布局图,10L120L反应器生产线,3条10L-120L生产线，
30、全年生产，满足产能需求。,10L-120L疫苗悬浮生产线工艺布局图,步骤五： 120L/650L微载体培养工艺中涉及培养基加液管、PBS加液管、胰酶加液管、消泡管道、补碱管道、细胞收获管、PBS排放管等多种工艺管道。步骤六：120L/650L微载体培养ST细胞生产猪瘟病毒工艺 ST细胞微载体培养基猪瘟病毒维持液 生产工艺严格执行GMP步骤七：场地和公用工程,年生产8亿毫升口蹄疫二价苗生产线,一条生产线配置：5L-120L-650L(两台)。一条650L反应器生产线的口蹄疫产能估算,车间疫苗生产线以及年疫苗生产能力 生产FMDV-O型的车间：1条生产线，年产2.1亿毫升。 生产FMDV-Asia1型的车间：1条生产线，年产2.1亿毫升。 年产口蹄疫二价疫苗约8.4亿毫升。,感谢您的关注，敬请指正！,
