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1、第五章 生物反应器及其检测与控制系统,第一节 概 述,一、生物反应器的含义广义：利用微生物、动植物细胞或酶等生物催化剂的功能进行生物化学反应的容器称为生物反应器。小至一支斜面和一只培养皿，达到几千立方米的发酵罐。按所使用的催化剂，可将其分为酶反应器和细胞生物反应器。通常只把那些能控制各种参数的比较完善的容器系统才称为生物反应器，尽管它的体积有时也可以有0.5L或更小。,目前市场上有各种规模的生物反应器供应，按其规模一般可以分为实验室规模：小于20L的反应器，主要用于培养工艺的研究；中试规模：20100L为中试规模，它主要用于提供一定量的产品，供纯化、临床前的各种检测和临床观察，也包括进一步的工
2、艺优化实验；生产规模：大于100L则为生产规模用生物反应器，它主要用于生产，提供产品。划分不是绝对的，尤其是对生物细胞培养和微生物培养是有一定区别的，对于前者来说，10L也可以称为中试规模，而用于培养微生物的反应器，有人将100L甚至1000L还看做中试规模。,二、生物反应器的基本要求生物反应器的用途：给动植物细胞或微生物的生长代谢提供一个最优的环境，从而促使其生长并在其生长代谢过程中产生出最大量最优质的所需产物。理想生物反应器必须具备基本要求：制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基，细胞直接接触的材料对细胞必须无毒。生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能。密封性能良
3、好，可避免一切外来的不需要的微生物污染。,对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和控制调节，控制的精确度高，而且能保持环境质量的均一。可长期连续运转，这对用于培养动植物细胞的生物反应器尤为重要。容器加工制造时要求内壁光滑，以减少细胞或微生物的沉积。拆装、连接和清洗方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修。设备成本要求尽可能低。,第二节 生物反应器的类型及其基本结构,随着微生物发酵工业和动植物细胞大量培养技术的发展，在传统的搅拌式生物反应器的基础上， 出现的新型生物反应器： 气升式生物反应器 固定床式生物反应器 流化床式生物反应器 袋式或模式生物反应器 中空纤维生物反应器 固定化培养的生物反应器等。
4、,一、搅拌式生物反应器搅拌式生物反应器是最经典和最早被采用的一种生物反应器，医药工业中第一个大规模微生物发酵生产青霉素的过程即是在机械搅拌式反应器内进行。到目前为此，对于新的生物过程，首先的生物反应器仍然是搅拌式反应器。它适用于大多数的生物过程，形成标准化的大量培养。它主要有以下一些部分组成（见下图P81）,1.罐体小于5L的实验规模是生物反应器一般用玻璃制作，大于5L的则用不锈钢。为了获得较好的混合和溶氧效果，用于培养微生物的罐体其高径（H/D)一般为23:1.但在培养动物细胞时，由于它对搅拌的剪切力敏感，搅拌速度一般较低，因此其径比一般采用11.5:1,以便增大液体与空气的接触面。采用不锈
5、钢制作罐体时，为便于观察，内部培养情况，常在罐体上装有视孔。在培养微生物时，由于搅拌速度较高，为防止形成湍流，在罐体上常装有挡板。,2.搅拌系统搅拌的目的是使细胞和养分在培养基中均匀分布，使养分能充分地被细胞利用，同时还可以使气体分散成较小的气泡，增大气液界面，有利于氧的传递。目前采用的搅拌系统主要有两种，一种是机械搅拌系统，另一种磁力搅拌系统，后者有利于罐体的密封，但不是用于大容量的搅拌式反应器。在培养微生物的发酵罐内，多数采用多层扁平叶片的涡轮式搅拌器，但在培养动物细胞的生物反应器内，一般倾向于采用较大的倾斜桨式搅拌器，特别在培养微载体时更是如此，它可在较低的搅拌式速度下使载体悬浮。,3.
6、加温和冷却系统多数采用夹套和盘管系统，用于进行加热或冷却，以满足不同微生物和动植物细胞生长对温度的要求。,4.进出气系统除厌氧菌的发酵培养外，其他的微生物和动植物细胞都需要不断供氧才能生长，空气需过滤除菌。培养微生物空气经装在罐体底部的气体分布器喷嘴形成气泡进入培养基。培养基内一般均含有蛋白质，在鼓泡通气时可产生大量泡沫，在罐体内常装有消泡桨。在培养动植物细胞时，气泡对细胞有一定的损坏，除改进分布器使气泡减少外，以开发多种无气泡的通气装置。或采用聚丙烯中空纤维膜或透气的硅胶管。采用孔径0.33的聚丙烯中空纤维膜，2.3m/L，其氧传递率为810.6mg O2/(L.h)。为避免排出气体中的水汽
7、使过滤器潮湿，在排气管路中加有冷凝装置。,5.进出也系统生物反应器生物反应器的培养和连续培养，具体可分为5种：批式培养：即将细胞和培养液一次性加入反应器内，待整个反映结束后将产物取出，流加或补料培养：即在培养过程中根据培养物质的代谢需要，补充某种或某些养料物质，多数是葡萄糖或谷胺酰胺等能源物质；半连续培养：即在培养过程中间隙地收集部分反应物，并补充部分新鲜培养基；,连续培养：即持续不断地收集反应物，同时持续不断地加入新鲜培养基，从而反应器内的反应条件处于恒定条件。将物化参数均一的反应器叫做恒化器，将保持细菌数目均一的叫做恒浊器；灌流培养：他与连续培养的不同处在于收集反应器时，细胞仍保留在反应器
8、内，这样可大大提高细胞密度，也就提高了反应器的生产效率。为适应这些培养方式的需要，生物反应器需相应的装配必要的进出液、收集、控制以及将细胞进行分隔回流等的设备系统。,6.检测和控制系统为了保证生物反应器的物化参数处在微生物或细胞生长的最佳条件下，现在的搅拌式生物反应器上均配备有各种传感器和控制系统，包括温度、Ph值、溶解氧、转速、液位等，有的还装备有测定罐压、培养物粘度、浊度等传感器。,7.管线和接头整套设备不可缺少的组成部分。实验室规模的小罐一般采用硅胶管，接头分别有内外磨口的玻璃接头、不锈钢接头等，它们都便于拆装，并可直接用火焰消毒以防止连接时污染。中试生产规模的管道和接头则均为不锈钢管道
9、和阀门连接。,二、气升式生物反应器气升式生物反应器特点：气体通过装在罐低的喷管进入反应器的导流管、致使该部位液体的密度小于导管外部区域的导管密度。从而使液体循环流动，它以气体为动力，靠导管装置的应道，形成气液混合物的总体有序循环。气内分：上升管和下降管。向上升管通入气体，使管内含气率升高，相对密度变轻，气泡变大，至液面处部分气泡破裂，气体由排气口排出。剩下气液混合物相对密度较上升管内的气液混合物大，由下降管下沉，下沉循环气升式反应器结构简单，不需要搅拌。有两种构型，内循环式和外循环式。与搅拌式生物反应器相比，剪切力小，混合均一，氧气和营养物质传递好，没有机械搅拌结构，有利设备密封，降低造价。,
10、见P83,为了培养基良好的循环和充分混合，反应器的高径比一般在10:1左右。在培养动植物相比时，为了减少因气泡的张力对成本造成的危害以及由此、产生的泡沫，要求通气时产生了气泡直径为12mm，空气流量为0.010.06vvm。该反应器可用于微生物和悬浮成本的批式生产，也可用于贴壁细胞微载体培养，并进行半连续、连续和灌流培养。,三、中空纤维式生物反应器中空纤维式生物反应器是由数百乃至数千根中空纤维集束组成的，该纤维材料为聚砜或丙烯共聚物。纤维壁厚5075，呈多孔性，内层为超滤膜，可以截留相对分子质量为10000、50000或100000的物质，内腔直径200，两端用环氧树脂等材料将纤维粘合在一起，
11、并使内腔开口与外加的塑料圆筒内，形成两个隔开的腔。内腔用于灌流充有氧气的培养基，外腔用于培养细胞。,中空纤维反应器既适应于贴壁细胞培养，液适应于悬浮细胞培养。当细胞接种于外腔后，细胞可附着于纤维表面，也可渗入海绵状纤维壁，13周后细胞可占据所有纤维间隙，并在纤维表面堆积，可达10多层细胞，细胞密度可保持较高的存活性、健康的形态和核型。该反应器占地空间小，产物质量高，生产成本低（生产ig纯化的单克隆抗体的生产成本，为用小鼠腹生产成本的2/1，为搅拌式生物反应器生产成本的1/6）。,四、透析袋或模式生物反应器在微生物或动物成本培养过程中，都会产生一些代谢产物，其中有些产物如乳酸、胺等会对细胞的生产
12、产生抑制作用，因此设计出了透析袋或模式反应器，可将这些有害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分开。最简单是直接将细胞置于透析袋内，并将其悬于一较大的盛有培养的容器内，然后旋转培养，容器内的培养基可不断更换，最后透析袋内的细胞密度可达107/ml，袋内单克隆抗体的浓度可达到12mg/ml。,模式生物反应器可由双式系统（培养基和细胞）或三式系统（培养基、细胞和产物）构成，每室间隙高0.6mm，大小为28cm x 32cm，面积约为500cm2（室内有不同的氟碳填料，其表面积14007000cm2），根据需要可反复重叠成3
13、0400层，总面积达735m2。室与室之间的膜，可采用微孔滤膜（用于保留细胞），也可采用允许不同相对分子质量物质通过的超滤膜（用于保留产物）。它既可用于培养贴壁细胞，也可培养悬浮细胞。该反应器的优点是既可使细胞达到很高密度（细胞室内达108/ml），又可随意组合操作，从而达到保留和浓缩产品或及时分离提纯产品的目的。,五、固定床或流化床式生物反应器固定床和流化床反应器：用于固定化酶反应，固定化细胞反应和固态发酵。固定化主要优点：可以重复利用生物催化剂，便于将生物催化剂与反应物分离。通过固定化酶技术可以将酶截流在反应器内以便连续进行酶反应。有些酶固化后化学和物理性质发生变化，选择性强，寿命延长。适
14、用于固定床和流化床的固定方法有物理吸附、共价结合、交联和包埋等。固定床反应的特点是结构比较简单，装填的材料可以是一切对细胞无毒、又有利于细胞贴附的材料，如不锈钢、有孔的玻璃、有孔的聚氨酯塑料等 。前一类材料细胞只能生长在表面，因而细胞密度不会太高，但比较经济，液体流动阻力较小，多数可重复使用，因而采用较多。后者由于有孔，细胞可进入载体内，因而可高密度培养细胞，但当载体过大时，在载体内的细胞常因营养物和氧的交换不够充分而影响其生长和代谢。,Verax公司推出的CF-IMMO培养系统多级流化床生物反应器及FS-2000流化床生物反应器专用于多孔微球的培养，微球由胶原制成，直径约500m孔径2040
15、m，比重为1.61.8g/ml。当培养液从流化床下部往上以一定流速输入时，微球在一定范围内悬浮旋转，从而保证了微球内细胞可获得充分的养分和氧气。用sf-2000培养cho工程细胞产生t-PA，细胞密度和t-PA产量达到了很高水平（1108/微球，94mg/L).,Celligen plus生物反应器是在原来的笼式通气搅拌式反应器基础上，将通气搅拌与固定床结合的一种生物反应器。它在原来的Celligen 罐体中部装一篮筐，中间装填由50%的聚酯纤维和50%的聚丙烯制备的直径为6mm的小圆盘，称为fibra-cel，它具有很大的比表面积（120cm2/cm3)和空体积，既可用于贴壁细胞的附着，又有
16、利于悬浮细胞在纤维间被固定。由于其设计特殊的搅拌装置，在搅拌中可产生负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养物和氧的传递。该反应器可使杂交瘤细胞和CHO工程细胞的密度达到108/cm3床体积，单抗和t-PA的产量较微载体培养分别高于12和27倍。,第三节 生物反应器的控制和检测系统,一、培养过程中需检测的物化参数在微生物和动植物细胞的培养过程中需检测的各种参数，其中有直接在线经传感器检出、需要取样离线检测、须经检测后计算才能获得。为了反应器个物化参数在细胞培养和产物分泌的最佳状态，反应器都装有传感器和控制系统。检测参数的全面性和控制系统的精确性反映了生物反应器的水平。,二 、生物传感器生物传感
17、器涉及物理信息学、生物芯片、生物控制论、仿生学、生物计算机等学科，处在生物科学和信息科学的交叉区域它们探索和提示生命系统中信息的产生 、存储、传输、加工、转换和控制等基本规律，探讨应用于人类经济生活的基本方法。生物传感器中应用的生物活性材料包括生物大分子、细胞、细胞器、组织、器官等以及人工合成的分子印迹聚合物。,生物传感器的分析原理是把特异性的酶（或微生物）固相化成酶膜（或微生物膜）紧贴在探头表面上，再用一种半渗透膜与被测溶液隔离。当溶液中的待测成分越过半渗透膜时，就会被固相生物催化剂莫吸附，形成复合体，随之进行生物化学和电化学反应，产生普通电化学装置能够感知的产物，如O2、H2、NH4+和C
18、O2等，并通过电化学装置转换为电信号输出。由于测得的电信号与待测物质的浓度相关联，故通过标准曲线或标定过的指示仪表既可确定待测物质的浓度。,与生物材料组合的传感器可以是多种类型的物理或化学传感器，如电化学（点位测定、电导测定、抗阻测定）、光学、机械、热、电等所有这些具有生物识别功能的组合体通称为生物传感器，包括核酸传感器和DNA芯片、免疫传感器、酶传感器、组织和全细胞传感器等。,与生物反应器相连的生物传感器包括温度传感器、转速传感器、PH传感器、消泡传感器、罐压传感器、溶氧传感器、空气传感器、O2流量传感器、CO2流量传感器、N2流量传感器、尾气分析传感器、葡萄糖传感器、氨基氮传感器、总氮传感
19、器等。分别使用力敏元件、光敏元件、磁敏元件、电化学传感元件等。,三、主要参数的检测和控制方法尽管各种参数对于了解微生物和细胞培养过程的优劣，以及优化培养工艺都很重要，但重要程度并不相同，也不是每个生物反应器都必须能测定所有这些参数，其中以温度、pH、溶氧、转速和进出液流量最为重要，控制了这些参数，加上培养基成分和细胞浓度，也就控制了其他各种参数和整个培养工艺。,1.温度对微生物和动植物细胞生长非常重要。培养物不同，温度要求不同。如哺乳动物细胞最佳温度为37左右；昆虫细胞则为27 ；微生物分为三类：低温菌（如发光细菌）、中温菌（如一般细菌、霉菌、酵母、放线菌）、高温菌（如枯草菌、嗜热脂肪芽孢杆菌
20、、温泉细菌），最适温度分别为1020 、2040 、5060 。一般来说，当温度低于细胞的最佳生长温度时，其代谢减弱但仍能存活，而温度过高则使其死亡。,常用检测温度的传感器：玻璃水银温度计、水银接触温度计、电阻温度计（铜电阻温度计、铂电阻温度计）和热敏半导体温度计等。有的反应器直接将探头插入培养基，有的则通过一套管，在套管内装入传热介质如甘油等，直接插入培养基内的传感器需耐高压蒸汽消毒。通过控温仪或微处理机以开关或三联式控制反应器的水套温度，或通过加热垫的开关达到对温度的控制。在培养低于室温的细胞和微生物时，常需配备冷却设备或对局部室温进行控制。,2.pHpH对微生物和动植物细胞各种酶活性，细
21、胞壁通透性，以及许多蛋白质的功能都有重要影响。目前普遍采用检测培养基pH的传感器是玻璃复合式参比电极，由玻璃电极和银-氯化银参比电极组成对培养基进行pH检测后，一般以比例控制或三联控制的方式来控制培养基的pH。由于NaHCO3 Na+HCO3- ，NaoH+H2CO3养初期，培养基通常偏碱性，此时主要靠电磁阀控制进入培养基的CO2量。,由于CO2 + H2OH2CO3 H+ + HCO-3 ，增加了氢离子浓度，使pH下降。随着细胞密度提高，代谢产物乳酸不断积累，pH开始下降，此时主要靠控制蠕动泵的开关，控制加入NaHCO3 (0.65mol/L)或NaoH(0.10.5mol/L NaHCO3
22、+ H2ONa+ + HCO-3 + H2O,而HCO-3 + H+ H2CO3 H2O + CO2，使PH上升。（见P 87）,为了使培养基的PH得到更好的控制，常常在配置培养基时添加某些缓冲系统。如磷盐酸缓冲系统；Na2CO3-CO2缓冲系统。还可加入缓冲剂如hepes、tricine和TES等。此外，用果糖代替葡萄糖作为碳源也有利于PH的稳定。,3.溶氧除了某些厌氧菌外，所有其他微生物和动植物细胞的生长都需要氧，需氧量因种类不同而异。动物细胞的氧消耗量为0.060.3mol/106细胞/h或2.4mg/106细胞/d。在短时期的缺氧条件下，细胞通过酵解途径继续生存。纯氧对细胞有毒害作用。
23、微生物分为专性厌氧菌、耐氧厌氧菌、兼性厌氧菌、微需氧菌和专性需氧菌五大类。对于需氧菌来说，其临界氧浓度，即所需的最低溶氧浓度一般在0.0030.05mol/L（相当于空气中的氧在培养液中平衡浓度的1%20%），其耗氧速率为0.050.25gO2/（g干菌体.h）。,目前用于生物反应器检测溶氧的传感器多数是极谱式或电流式覆膜电极，其原理都是：当给浸入稀盐溶液的两根电极间加上合适电压时氧被还原，是线路中产生电流。电极可纯铅或银组成，也可由铂和银组成。为防止裸露的电极表面中毒，降低电流输出，也为了防止培养基内除氧以外的其他可溶成分被还原，以及搅拌对电极的干扰，在电极顶端加一透气膜，并用一薄层电解液将
24、其与电极分开，从而构成了腹膜电极。为提高电极的敏感性需选择薄而透气性高度膜。,由于氧属于难容性气体，在25 、一个大气压时氧在纯水中的平衡浓度为8.5g/m3，在培养液中则不高于8g/m3。而实际能被细胞和微生物利用的不到溶解氧的20%，大部分未被利用者从反应器中排出，因此如何控制氧的供应，提高氧传递，是化学工程研究的课题，是反映生物反应器性能好坏的一个重要标准。微生物发酵时，对溶氧的控制主要通过溶氧电极的信号，以三联控制或简单的开关控制方式控制气体阀以及改变搅拌速度；在进气量增大引起大量泡沫时，可通过电接触点式液位测量和控制系统，使自动加泡沫剂装置动作，定时定量的加入泡沫剂。,对动物细胞，由
25、于对由气泡和搅拌引起的剪切力都很敏感，因此要保持所需溶氧比较困难，采用措施有：改变进气的组分。为适应动物细胞的生长需要，以三联控制方式调节进气的比例。培养后期当细胞密度很高时，可用氧气代替空气。适当提高罐压，关小排气口(有利氧在培养基溶解)。加大通气量。防止措施气泡，采用无气泡，通气装置，如透气硅胶管等。适当提高转速：为避免剪切力的影响，可加入pluronic F68（0.01%0.1%）等试剂提供一定程度的保护。还可采用微囊、多孔微球等培养技术。在反应器外通气：先在培养基储液罐内通气，使氧达到所需的饱和度，然后送入反应器，并可通过控制其循环速度以满足细胞生长对氧的需求，这样就可减小因气泡和搅
26、拌对细胞的损害。,4.搅拌搅拌的作用在于使罐内的物料充分混合，有利于营养物和氧的传递，因此在可能的情况下总希望采用较高转速，如在微生物培养时一般转速在400r/min以上。在动物细胞培养时，由于它们没有细胞壁，对剪切力较敏感，搅拌速度100r/min左右；采用微载体培养时，为使细胞良好贴附而不脱落，搅拌速度4060r/min.目前搅拌的控制一般靠实践经验加以人为的设定和调节，并采用电磁感应技术用转速器显示其转速。,在控制进出液流量时需要注意如下几点： 采用蠕动泵时要经常检查以防硅胶管磨损破裂，要经常变更与滚柱相接触的硅胶管部位。 可同时装备检测液面水平的电接触点探头，并用以控制进液泵。当液面与
27、触点电极接触时，进液泵就会停止进液，以此维持罐体内的物料量，同时保持进出液量的平衡。 如无液位计，可采用抽液量稍大于进液量的方法，并将出料口置于液面下一定高度，使抽液不至于过多，同时防止了进液量过大溢出罐外。在灌流培养时除了要控制进出液平衡外，还需使细胞与排出液分离，以保持和提高反应器内细胞的密度。,其他上述五个方面可以说是最重要的，也是最基本的控制参数。此外，在细菌发酵中，罐压、液位、粘度以及排出气体中O22和CO2浓度的连续测定等也常被采用。随着生物工程迅猛发展，生物反应器的种类、规模及其检测和控制手段都有了很大发展和提高，但其生产水平仍大大低于细胞在体内的表达水平，因此仍需要改进和提高现有生物反应器的强度和生产效率，优化各种理化参数和条件，才能真正做到优质、高产、低成本地生产出各种生物制品，以满足人民日益增长的需要。,
