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1、液相色谱教程 (三)液相色谱实验操作,Waters 中国有限公司培训中心,启动液相色谱仪器的流程,开启HPLC系统各个设备的电源打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算机，启动色谱管理软件准备流动相过滤,脱气色谱泵排气用新配制的流动相灌注泵,启动液相色谱仪器的流程,用准备好的流动相平衡色谱系统可在泵的控制面板上设定流速参数(155泵需在软件控制下操作)系统大约需平衡0.5-1小时方能稳定工作准备样品用流动相溶样或重组样品编制仪器方法,开始实验,液相色谱对流动相的要求,色谱柱对流动相的要求过滤除去微粒纯度的要求超纯水，或用KMnO4处理过的双蒸水有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含
2、量尽可能低)， 并与填料相匹配缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在pH2-8)内缓冲液（盐）的浓度不要太高(100mM)流动相对样品的溶解度调整有机溶剂和水的比例最好用流动相溶样,液相色谱对流动相的要求,液相色谱仪器对流动相的要求与检测器匹配脱气避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统）溶剂的粘度防止细菌的生长,流动相的脱气,流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液量均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化,流动相脱气的方法,加热简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造
3、成流动相组成的变化抽真空同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果超声波振荡简单，但效果不够理想；超声时间不要太长(1分钟左右即可)通惰性气体（一般用氦气）可保持在线连续脱气，多用于低压梯度在线脱气机 （in-line degasser)可保持连续脱气，多用于低压梯度,流动相的保存,有机溶剂流动相:室温下密封,避光保存缓冲盐流动相:当日现配现用低温下密封保存,一般不超过3天防止微生物生长有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:低温密封保存防止有机相的挥发选用适宜的容器,分,保存于聚乙烯瓶中的超纯水,测试条件水样: 40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱柱: C18 反
4、相柱 (Waters)梯度: 线性 100% 水 100% 乙腈波长: 254 nm,保存于棕色玻璃瓶中的超纯水,测试条件水样: 40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱柱: C18 反相柱 (Waters)梯度: 线性 100% 水 100% 乙腈波长: 254 nm,色谱泵的排气操作,色谱泵实验前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按以下步骤排气：将泵入口管吸滤头放入脱过气的流动相中打开泵及在线脱气机电源开关将排液阀打开，或断开与色谱柱连接的管路设置流速到6-9ml/min,排液阀出口有液流连续流出必要时(600泵)用10ml注射器从泵入口注入流动相对于600,
5、2695四元梯度泵,分别对所用各路溶剂进行排气操作 停止泵流速,关闭排液阀,恢复断开的管路,备用注:泵排气后,应输液稳定(系统压力脉动小,一般在几十 Psi以内),否则,需重做排气操作,Waters 515 泵的前面板,电源开关柱塞杆清洗孔排液阀,Waters 600泵的前面板,柱塞杆清洗孔,电源开关,排液阀,泵控制器,泵体,泵灌注阀,Waters 2695 分离单元,2695排气操作示意图,面板操作 :打开状态(Statas)画面 按右下角Direct Function功能键选 Dry Pime或 Wet Prime命令选OK 即可进行泵的排气注:当流路中充满空气时, 按图示做Dry Pri
6、me若只是更新流动相时, 只须作Wet Prime,关于色谱系统的反压,什么是反压(back pressure)流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压, 又称系统反压或系统压力Waters习惯用的压力单位是Psi(磅/平方英吋)其它单位有:Bar,Mpa影响系统反压的主要因素:流动相的溶剂组成温度流速,反压与溶剂组成的关系,流动相的粘度是产生反压的主要原因有机溶剂水的粘度随组成而改变其压力随组成变化如下图所示,反压与流速的关系,流速对反压的影响是线性关系流速增加，反压亦增大 下图的实验条件：2.130mm Symmetry C18柱,20,反压与温度的关系,温度对反压的影响是反比关系温
7、度升高,反压降低,对某些流动相的影响更大一些,影响系统反压的其它因素,反压与色谱柱长度成正比反压与填料颗粒度的平方成反比2.5m填料比3.5m填料反压高反压与管路直径的四次方成反比 (1/D4)反压与管路的长度成正比,色谱泵的运行,排气后的色谱泵即可用于实验运行注意排气后，先设流速为 0恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱如需要，恢复排气时断开的控制线根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过渡(包括排气操作),色谱泵的维护保养,流动相要过滤常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水冲洗柱塞杆清洗孔关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准更换流动相时，
8、要保证两种溶剂的互溶性,如不互溶，要用一种中间溶剂过渡色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中,液相色谱系统的清洗与钝化,色谱泵吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染,应作清洗和钝化处理一般采用30磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜,色谱泵及系统的清洗,清洗液用30%磷酸水溶液30%磷酸配制:取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀清洗步骤如下:取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,
9、D四路各为25%)用30%磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速)45分钟 (四元泵的A,B,C,D四路各为25%) 换成清水洗至出口水pH显中性用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用,色谱泵及系统的钝化,钝化液用6M硝酸水溶液6M硝酸的配制:取浓硝酸40ml与60ml水混匀钝化步骤如下:在清洗步骤完成后进行钝化处理确认清洗用的磷酸已基本洗净用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%)用6M硝酸水溶液钝化系统(1ml/min流速)45分钟换成清水洗至出口水pH显中性用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用,实验样品的制备,标样和样品标样:又称对照品,它作为液相色谱定性和定量分析的参 考标准物,一
10、般是纯度较高的纯物质样品:待测物,一般是成分复杂的混合物液相色谱对样品(包括标样)制备的要求:必须能溶于流动相如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度,以免在进样时样品在流动相中析出,堵塞管路和色谱柱 样品溶液要过滤除去微粒及杂质了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用,复杂样品的预处理,样品预处理的目的除去微粒减少干扰杂质浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果有利于保护色谱柱及仪器,样品预处理的重要性,是影响实验成败的决定性步骤占样品分析时间的比例最大样品预处理所用时间远多于色谱分离的时间占分析消耗总成本的比重最大消耗大量的溶剂及其它化学品对分析结果的重现性及准确性影响
11、最大的环节影响实验结果好坏的最重要因素,样品预处理常用的方法,高速离心取上清液过滤、超滤选择性沉淀衍生反应液-液萃取固相提取(Solid Phase Extract,SPE )Oasis和Sep-Pak固相提取小柱其它,去除微粒的方法,过滤过滤膜/过滤装置有机滤膜(0.5 m)/水溶性滤膜(0.45 m)膜片可更换一次性使用的膜“Cartridge”使用方便简单，交叉污染小有更小内径，可用于微量样品的处理高速离心大于：10,000rpm,超滤,机理超滤是一种基于分子量分离的技术目的根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份除去小分子样品中的大分子蛋白脱盐,选择性沉淀,常用于生化样品中除
12、蛋白有机溶剂乙腈，甲醇强酸三氯乙酸，高氯酸盐50% 硫酸铵10% TCA(三氯乙酸钠),样品衍生,提高检测的灵敏度增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度增加荧光基团以便使用高灵敏度荧光检测器改变分离的选择性改变组份的基团，如：变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离典型的例子柱前衍生氨基酸分析,AccQ-Tag 衍生法,浓缩样品,目的：富集微量或痕量组份浓缩样品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 固相提取 Oasis小柱 Sep-Pak小柱,Oasis HLB固相提取小柱,亲水-亲脂平衡共聚物,“亲水”使填料具有水可浸润性质降低与水的接触角,“亲脂”提供对被分析物质的反相保留能力,这是适合于
13、分析众多基质中大多数样品的通用操作步骤建议首先使用这种通用的操作步骤如果需要进一步降低干扰物的影响，可使用二维SPE方法注:此方法于规格为3cc,60mg的OasisHLB 小柱上开发,样品预处理的通用SPE方法,SPE处理的效果,进样器的使用,进样器的种类:手动进样器7725i自动进样器717Plus，2695样品管理系统进样器与系统的连接：进样器的入口与色谱泵的出口相连进样器的出口与色谱柱的入口相连要求：出入口方向不能接错，接头不能留有空隙进样器的连接管路：出口管路一定要用细管(内径0.009),长度要短,尽量减少谱带扩展,手动进样器的使用,7725i手动进样器的进样方式:固定体积进样:进
14、样量取决于Loop的体积可变体积进样:进样量由微量注射器量取注意:固定体积进样需要用超过Loop体积5-10倍的样品量进样,以保证进样浓度不被稀释可变体积进样在注射器注入样品后,应尽快将进样器扳至Inject位置,以避免样品在Loop中的扩散进样器的清洗:每次进样前应将微量注射器清洗干净,防止样品间交叉污染,影响实验结果,自动进样器的使用,自动进样器(717Plus和2695样品管理系统):样品瓶位置和进样量由软件设定注意:样品瓶中应有超过13瓶高度的样品量使用内衬管(Insert)时应设定针高度为2mm(2695)或 75%高度(717Plus)进样器的清洗:进样针是流路的组成部分,运行中一
15、直由流动相清洗进样针外部由软件控制在每次进样前用洗针液清洗若注射器内出现气泡，用面板操作的Purge Inject功能清除之,自动进样器的洗针液,注意洗针溶剂瓶(内放绿色塑料管)不要放在仪器的上部，应放于与仪器同一水平面的实验台上,洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：,检测器的启动操作,连通流路：色谱柱出口接检测器入口注意接头不要留有空隙连接管路要用细管(0.009)检测器出口用适当的管路(内径,长度)通向废液瓶连通数据线路:IEEE 电缆(对大多数检测器)与软件busLAC/E卡连接手动进样器的启动信号线与检测器背板上的Inject Start 接口连接开启电源开关后,需待检测器通过自检后,才
16、能被软件控制(约需5-10分钟)通流动相平衡至少30分钟后才能正常工作,Waters 2487 检测器,2487的显示屏幕,通道,吸光度,灯开/关,波长,灵敏度,下一画面,运行时间(分),自控/遥控,诊断开/关,键盘锁开/关,单/双波长,Shift 开/关,AUFS(Absorbance Unit Full Scale):满量程吸光度单位,2487的面板及操作,回车键,分屏显示键,选项移动键,主屏幕,方法调用，A/B通道切换,设置及诊断,单/双波长，自动调零,运行/停止键,第二功能键,监视色谱图,屏幕对比度,Waters 2996 PDA 检测器,PDA(PhotoDiode Array):光
17、电二极管矩阵,由软件设定检测器参数,只需设定如下参数即可采集数据波长范围分辨率每秒采集的光谱数操作极为简便不需费神选择参比波长及其带宽,Waters 2414示差折光检测器,2414的显示屏幕,冲洗参比池,折射率,极性,RIU量程,检测器温度,下一画面,运行时间(分),自控/遥控,键盘锁开/关,模式,Shift,2414的面板及操作,回车键,屏幕对比度,选项移动键,主屏幕,方法调用，温度设置,自动调零,运行/停止键,第二功能键,监视色谱图,冲洗参比池,设置及诊断,下一页,2414检测器的日常操作,设定检测器内、外(如有柱温箱)温度以5ml/min的流速“purge”参比池五分钟不接色谱柱！参数
18、设置按文献值或实验决定至少需要2小时以上的平衡时间通常检测器可以在白天结束工作后不关机，保持0.1到0.5ml/min的流速循环冲洗样品池和参比池,可节省第二天的平衡时间,使用示差检测器的注意事项,不能做梯度实验最大的池耐压是 100 psi注意保持出口管路的畅通流速范围是 0.1 - 10 ml/min 此种类型检测器是压力敏感和温度敏感型检测器注意保持泵压力的平稳注意环境温度的恒定,Waters 2475荧光检测器,2475 检测器的特点,可调波长荧光检测器双扫描在扫描模式下(Scan)发射波长及激发波长均可扫描高灵敏度水的RAMAN峰S/N大于200可编程 时间 - 波长 时间 - 增益
19、由RS232串行口或网线与计算机相连,2475的主显示屏,发射/能量,灯开/关,下一页,运行时间(分),面板/软件控制,键盘锁/开,Shift开/关,单/多波长,通道选择,增益,波长,诊断键开/关,灵敏度,2475的面板及操作,回车键,分屏显示键,选项移动键,主屏幕,方法调用，通道切换,设置诊断,自动调零,运行/停止键,第二功能键,监视色谱图,开关灯,屏幕亮度调节,光谱扫描,2475 荧光检测器的扫描功能,扫描功能 由面板功能执行Empower 英文版亦能由软件执行,荧光检测器使用注意事项,不是所有化合物都有荧光，有时需要衍生检测器对溶解气体及其它“淬灭”物质(如甲醇)敏感,流动相最好能在线脱气对Ex及Em的最佳，易受温度、溶剂极性和粘度、pH及样品浓度影响检测池的耐压较低,注意出口管路要畅通设置的发射波长至少要比激发波长高10nm,流动相脱气与否的信号比较,样品浓度对激发和发射波长的影响,检测器的使用和保养,如长时间不用检测器可以关掉光源灯(UV,FL)仅在4小时以上不用时,才需关灯频繁开关灯也会影响灯寿命不要让缓冲液长期停滞在检测池内用纯水冲洗保存在纯甲醇中示差检测器及荧光检测器若与其它检测器串联使用,应将此两种检测器串在其它检测器的后面不用检测器的液晶显示屏时，应将其亮度调暗,
