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1、2016.12.05,抗体的生产制备,11/14/2022,2,特异性抗体的制备与纯化技术,多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体（杂交瘤技术）,单克隆抗体与多克隆抗体,11/14/2022,3,11/14/2022,4,抗体发展史,抗体制备技术主要经历了三代：第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）；第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）；第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体（genetic engineering a
2、ntibody）。,第一节 多克隆抗体的制备与纯化,11/14/2022,5,克隆（clone）:是指无性繁殖细胞系，是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。多克隆抗体（polyclonal antibody , pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫细胞，可刺激多个B细胞克隆产生针对多个抗原表位的不同抗体。多获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）:由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性
3、。,11/14/2022,6,多克隆抗体（抗血清）的制备流程,11/14/2022,7,（一）抗原的制备（二）免疫动物（三）免疫血清的收集、分离和保存（四）抗体的纯化（五）免疫血清的鉴定,（六）免疫失败的可能原因及应采取的措施,11/14/2022,8,（一）抗原的制备,免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞；抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）免疫原天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；,免疫原的分类：（一）细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）（二）可溶性抗原制备：
4、 指蛋白质、多糖和脂类等。,11/14/2022,9,细胞性抗原：主要包括人、动物的细胞，还有细菌、螺旋体及寄生虫等。如菌体（O）抗原的制备：选择标准菌株，接种于斜面或平板培养基表面；置温箱37 培养24h，用适量的无菌生理盐水刮下菌苔，移入无菌含有玻璃珠的三角瓶中，充分摇匀菌体；100 水浴22.5h杀菌并破坏鞭毛抗原。取处理过的菌液，检测有无活菌的存在，合格后用无菌生理盐水稀释成每毫升8亿10亿个细菌，加入苯酚（石炭酸）至最终浓度为5，即为O抗原。,1）细胞性抗原或颗粒性抗原,2）可溶性抗原,11/14/2022,10,可溶性抗原主要包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、补体、细菌外毒素
5、、核酸等。它们大多数来源组织细胞，成分复杂。制备这类抗原时，首先需将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的成分，提纯后的抗原需鉴定后才能用做免疫原。 （1）组织匀浆的制备：所有的组织必须是新鲜的或低温保存的。器官或组织获得后立即去除表面的包膜或结缔组织以及大血管，在4 水浴或冰浴中将洗净的组织剪成小块，加入适量生理盐水，装入捣碎机破碎制成组织匀浆。 （2）细胞破碎：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常用方法有冷热交替法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和酶处理法等。,（3）蛋白提纯,11/14/2022,11, 超速离心法：常用密度梯度介质有蔗糖、甘油； 选择性沉淀法（盐析沉淀法）：其
6、原理是根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。如选用3350饱和度的硫酸胺收集沉淀物；,11/14/2022,12, 凝胶层析法（分子筛层析）：蛋白质分子按大小被分离； 离子交换层析；带电的生物大分子和离子交换色谱填料上的离子基团进行交换而被分离纯化。以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离； 亲和层析：利用生物大分子的生物特异性如抗原抗体、激素受体、IgG和葡糖球菌蛋白A（SPA）； 制备电泳技术。,11/14/2022,13, 其它,聚丙烯酰胺凝胶胶内蛋白 可将抗原所
7、在的电泳条带（或蛋白点）切下,研磨后直接用以动物免疫。 NC膜结合蛋白 将含目的分子的蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移至NC膜上，丽春红显色至清晰显示目的条带，取目的条带置于加有PBS的1.5ml离心管中，用PBS洗至无色，继而剪碎、研磨，用于动物免疫。,11/14/2022,14,分离纯化方法的比较,（4）纯化抗原的鉴定,11/14/2022,15,含量测定：采用常规蛋白或糖类浓度测定法，一般采用分光光度计测量法；相对分子量的鉴定：一般采用SDS-PAGE电泳法；纯度鉴定：常用区带电泳法鉴定。,3）半抗原,11/14/2022,16,半抗原物质多数为低分子质量的物质，如：多糖、多肽、甾体激
8、素、脂肪胺、类脂质、核酸、某些药物及其它化学药品；常用载体：蛋白质类如：牛血清白蛋白、人血清清蛋白、兔血清清蛋白等。多肽聚合物：如多聚Lys（赖氨酸） 大分子聚合物：如羟甲基纤维素；半抗原载体连接方法：常用物理法和化学法。 物理吸附的载体有羟甲基纤维素等，其借助电荷和微孔吸附半抗原； 化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上。,11/14/2022,17,某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。,四）免疫佐剂,良好的佐剂应当具备以下条件：增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基
9、团构型，从而增强抗原的免疫原性；佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，降低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫；具有无毒性或副作用低的特点。,11/14/2022,18,佐剂一般包括以下几类：无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；人工合成佐剂： 如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；纳米
10、佐剂,1、佐剂的种类,11/14/2022,19,应用最多的是弗氏佐剂和细胞因子佐剂弗氏佐剂： 不完全佐剂:液体石蜡+羊毛脂 完全佐剂:液体石蜡+羊毛脂+卡介苗 弗氏佐剂：抗原=1：1 乳化成“油包水”乳液 （乳化方法主要有研磨法和注射器混合法）。 完全佐剂一般不连续2次使用细胞因子佐剂： IL-2 IL-1 IFNr（羊痘病毒干扰素受体） CSF（集落刺激因子）等,11/14/2022,20,增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原；增强机体对抗原刺激的反应性：提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度；改变抗体类型：使产生抗体由IgM型转变为IgG型；引起或增强迟发性超敏
11、反应。,2、 佐剂的免疫生物学作用,11/14/2022,21,佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种： 可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性。 佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放。 增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增强和扩大免疫应答的效应。,3、佐剂的作用机制,二、动物免疫,11/14/2022,22,选择动物时应考虑以下因素：抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而
12、同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。,（一）免疫动物的选择,11/14/2022,23,选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间隔等因素。1、免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。,（二）免疫方法,免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。免疫间隔时间
13、是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，一般以1020天为佳，二次后间隔时间一般为710天，若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高。,2、免疫途径与免疫间隔时间,11/14/2022,24,（三）免疫血清的收集,1）采血前测抗体效价 在第2次加强免疫后2周，从兔耳缘静脉取23ml血，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。 抗血清的效价：就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双向扩散等方
14、法测定。前者测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。,11/14/2022,25,放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原（放射性核素标记）混合，孵育24h后，测定其结合率（用液体闪烁计数仪测定Ag*Ab或游离Ag*）。通常以结合率为50%的血清稀度为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起注意。,11/14/2022,26,双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断
15、抗血清中是否有抗体及其浓度。琼脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔内加适量抗原（容量为50l），周围各孔内分别加入50l 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37下孵育24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度。,2）抗血清的采集,11/14/2022,27,采集：颈动脉放血、心脏采血、静脉采血分离：室温自然凝固12
16、h，然后放4冰箱过夜，待血块收缩后分离血清，有些血清须经5630min 使补体灭活。保存：4保存存放3个月至半年 低温保存（-70 -20 ）2至3年，忌反复冻融 真空干燥保存4-5年,注意：保存前需经除菌 保存液含防腐剂 避免反复冻融（分装）,11/14/2022,28,（四）、抗体的纯化,1、目的：尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分2、纯化方法1）单价特异性抗血清的纯化 单价特异性是指抗血清只与其特异性抗原发生反应。 去除杂抗体主要方法：亲和层析法（将引起交叉反应的共同抗原交联到Sepharose 4B柱上，把要处理的抗血清通过亲和层析柱，共同抗体吸附在柱上，洗脱液则含有特异性抗体）；
17、 吸附法（指将非特异性抗原液与戊二醛制备成固相吸附剂按1：10直接加到免疫血清中去除杂抗体）,2）特异性IgG类抗体的纯化,11/14/2022,29,硫酸铵盐析：先用50%饱和度去除白蛋白，再用2次33%饱和度沉淀免疫球蛋白。离子交换层析：常用的离子交换剂有DEAE纤维素和QAE纤维素。以QAE-Sephadex最理想。能吸附血清中多种蛋白质，但不能吸附IgG.亲和层析法：将纯抗原交联到Sepharose4B，装柱后，将抗血清通过亲和层析柱，特异性吸附IgG。凝胶过滤法：分子筛层析,11/14/2022,30,（五）免疫血清的鉴定,1. 效价的测定：颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗原常用双
18、向免疫扩散试验、ELISA等方法。,2. 特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、免疫电泳法。3. 纯度的鉴定： 抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向扩散试验、免疫电泳等方法。 IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE结果应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需进一步纯化。4. 亲和力的鉴定：测定抗体亲力的方法较多，如平衡透析法、ELISA或RIA（放射免疫技术）竞争结合试验等。,第二节 单克隆抗体的制备和应用,11/14/2022,31,第二节 单克隆抗体的制备和应用,11/14/202
19、2,32,单克隆抗体的优点,单特异性和均一性,无限供应,用混合的抗原制备出识别一个抗原决定簇的抗体,11/14/2022,33,杂交细胞（hybrid cell） 在外界某些条件干预下（如PEG、电穿孔），当两个细胞紧密地接触的时候,其细胞膜可能发生融合，产生具有原来两个细胞染色体/基因的单个细胞，称为杂交细胞。,11/14/2022,34,杂交瘤细胞（Hybridomas） 若用一种肿瘤细胞与另一种体细胞（如淋巴细胞）融合，所形成的杂交细胞称为杂交瘤细胞，简称杂交瘤。其既具有肿瘤细胞无限增殖的能力，也具有淋巴细胞的一些特性。 B淋巴细胞杂交瘤 骨髓瘤细胞与免疫B细胞融合所产生的杂交瘤细胞。,
20、11/14/2022,35,杂交瘤细胞,单克隆抗体的制备,11/14/2022,36,11/14/2022,37,抗原制备免疫动物骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备细胞融合 杂交瘤细胞的选择培养 杂交瘤细胞的筛选及克隆化单克隆抗体的鉴定 单克隆抗体的制备,单克隆抗体制备的主要步骤,一、抗 原,11/14/2022,38,细胞、细菌和病毒等，一般具有较强的免疫原性，可不加佐剂。例如，直接腹腔注射12107个细胞。,颗粒性抗原：,可溶性抗原的来源主要是天然纯化，或者用目的基因在原核或真核细胞内表达。可溶性抗原需与弗氏完全或不完全佐剂混匀，进行免疫。,可溶性抗原：,11/14/2022,39,B淋巴细胞在目
21、的抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特异性抗体的B淋巴细胞，有利于细胞融合形成分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。多次免疫可通过抗体亲和力成熟机制，使B细胞分泌高亲和力抗体，由此形成的杂交瘤往往可分泌高亲和力抗体，有更高的应用价值。,二、免疫动物,免疫目的：,11/14/2022,40,采用与骨髓瘤供体同一品系的动物 免疫动物品系（脾细胞供体）和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远则产生的杂交瘤越不稳定，获得的杂交瘤不能在该品系小鼠体内诱生腹水。,动物的选择：,动物对抗原刺激易产生免疫应答反应,8 12周龄雌性小鼠（最常用BALB/c）,11/14/2022,41,11/14/2022,42,11/14/20
22、22,43,三、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备,骨髓瘤细胞系的选择要点：,自身不产生免疫球蛋白的重链与轻链 所选择的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物 品系相同,对氨基碟呤敏感,与免疫脾细胞融合后产生稳定分泌Ig杂交瘤细胞,11/14/2022,44,饲养细胞的作用：,小鼠腹腔巨噬细胞小鼠脾细胞,饲养细胞（feeder cell）：,增加细胞密度，满足新生的杂交瘤细胞对细胞密 度的要求 吞噬清除死亡的细胞 分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞的生长,饲养细胞的种类和制备方法：,11/14/2022,45,四、细胞融合,融合前的准备工作,准备HAT、HT培养液、融合剂PEG准备饲养细胞准备骨髓瘤细胞准备免
23、疫脾细胞,11/14/2022,46,拉颈处死小鼠无菌操作取出脾脏清洗、研磨收集细胞离心洗涤细胞计数,脾细胞的准备,11/14/2022,47,收集细胞离心洗涤活细胞计数调整细胞浓度,骨髓瘤细胞的准备,细胞融合,11/14/2022,48,骨髓瘤细胞与脾细胞 按一定比例混合1: 10或1: 5 加入促融剂PEG,PEG,11/14/2022,49,在聚乙二醇作用下B淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞,11/14/2022,50,五、杂交瘤细胞的选择性培养,HAT选择性培养的原理： 细胞的DNA生物合成有主要途径和补偿途径。当有氨基碟呤存在时，能够阻断DNA合成的主要途径，需通过补偿
24、途径合成DNA，这时就需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用次黄嘌呤合成DNA，或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷合成DNA。,11/14/2022,51,11/14/2022,52,用于杂交瘤融合的骨髓细胞缺乏HGPRT和TK，在HAT培养液中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT和TK ，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的B淋巴细胞虽具有HGPRT和TK ，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有骨髓瘤细胞与免疫B细胞融合的杂交瘤既有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又从免疫B细胞得到HGPRT和TK 的基因产物，因此，能够克服氨基碟呤的阻断作用，通过次黄嘌呤的补偿
25、途径合成DNA，而在HAT选择培养液中生长繁殖。,11/14/2022,53,11/14/2022,54,融合后34天后，可见外形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮的克隆。 融合后第79天取培养上清，检测特异性抗体。,细胞生长情况,六、杂交瘤细胞的筛选及克隆化,11/14/2022,55,杂交瘤分泌单克隆抗体的检测方法,免疫酶技术间接ELISA 包被抗原、培养上清、酶标抗体、加底物显色 阴性对照：骨髓瘤细胞培养上清 阳性对照：免疫鼠血清 免疫荧光技术,间接免疫荧光（或酶）测定法：靶细胞铺片、 固定细胞、加待测样品、加荧光标记抗体（或 加酶标抗体和显色底物）、镜检 活细胞免疫荧光技术：流式细胞术分析,11/
26、14/2022,56,杂交瘤细胞的克隆化,在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。克隆化即把培养孔中的细胞从单个细胞进行培养繁殖，使之成为单克隆，其分泌的抗体达到均一性。,克隆化的方法主要有：有限稀释法、软琼脂培养法,11/14/2022,57,有限稀释法,11/14/2022,58,（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。（2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。（3）调整细胞为310个细胞/ml。（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100l。孵育于37、5%CO2孵箱中 。（5）在第7天换
27、液，以后每23天换液1次。（6）89天可见 细胞克隆形成，及时检测抗体活性。（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。（8）每个克隆应尽快冻存。,有限稀释法克隆,11/14/2022,59,软琼脂培养法以适当浓度杂交瘤细胞加入软琼脂培养基中，形成由一个细胞增殖而成的细胞集落。,杂交瘤细胞的克隆化筛选：,11/14/2022,60,11/14/2022,61,免疫球蛋白类别及亚类的鉴定,七、单克隆抗体的鉴定,小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞，其分泌的特异性McAb的本质仍是小鼠的不同类型及其亚类的免疫球蛋白Ig），其中以IgG（IgG1、 IgG2a、IgG2b和IgG3等亚
28、类）最常見，其次为IgM。,11/14/2022,62,抗体亲和力是指抗体与抗原或半抗原结合的强度，其高低主要是由抗体分子结合表位部位和抗原决定簇之间的互补程度决定。,特异性 是否与其他抗原有交叉反应敏感性 对腹水和培养上清进行效价测定 亲和力测定,八、单克隆抗体的制备,11/14/2022,63,大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：（1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清液中获取单克隆抗体。（2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。,11/14/2022,64,将杂交瘤细胞置于培养瓶（或灌）中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体。收集培养上清液，离心去除细胞及其碎
29、片，即可获得所需要的单克隆抗体，不含无关Ig，但成本髙。,体外培养法,（1）,11/14/2022,65,实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按13107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共24点。待肿瘤达到一定大小后（一般1020天）则可采血，从血清中获得单克隆 抗体的含量可达到110mg/ml。但采血量有限。,（2）体内接种杂交瘤细胞,腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，12周后腹腔注射1106个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获510ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到510mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。,11/14/2022,66,取Balb/c小鼠, 首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。 12周后, 腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体,11/14/2022,67,约12周, 可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。,11/14/2022,68,THANKS!,
