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1、食品中大肠菌群的测定 多管发酵法,大肠菌群的概念,大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。包括埃希氏菌属、枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属,测定意义,大肠菌群作为粪便污染指示菌。即在食品中检出大肠菌群，不仅反映食品被粪便污染总的情况，一定程度上也反映了食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况，具有广泛的卫生学意义。凡是大肠菌群数超过规定限量的食品，即可确定其卫生学上是不合格的，该食品使用是不安全的。,大肠菌群数量的表示方法-MPN,MPN: Most Probable Number(大肠菌群最可能数) 是
2、采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值。,三管系列：对样品进行连续10倍梯度系列稀释，选择3个连续的合适的稀释度，每个稀释度接种3管到乳糖胆盐发酵管内培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，查取大肠菌群最可能数(MPN)检索表，报告每100mL(g)检样大肠菌群的最近似数。,大肠菌群MPN的检验方法-多管发酵法,大肠菌群的检验程序,过程,检样稀释乳糖初发酵试验（假定试验）分离培养乳糖复发酵试验（证实试验）报告,检样稀释,1. 检样25mL(25g)放于含有225mL无菌生理盐水的三角瓶内，经充分振摇作成1:10的均匀稀释液。固体检样用无菌均质器。以8000-10000r/
3、min的速度处理1min，做成 1:10的均匀稀释液；,检样稀释,2. 用1mL无菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL无菌生理盐水的试管内，振荡混匀，作1:100的稀释液；3. 另取1mL无菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液，每稀释一次换用 1支1mL无菌吸管；,检样稀释,4. 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况估计，选3个稀释度，每稀释度接种3管。 每100mL消毒乳中大肠菌群MPN不超过40个,乳糖初发酵试验（假定试验）,目的：检查样品中有无发酵乳糖产酸产气的细菌。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内;乳糖：选择作用，大肠菌群能发酵乳糖产酸产气;胆盐：抑制其它杂菌，特别是革兰
4、氏阳性菌；溴甲酚紫：pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色，溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢杆菌生长的作用。,乳糖初发酵试验（假定试验）,接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管；每一稀释度接种3管，置(361)温箱内，培养(242)h，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为大肠菌群阴性。如产气，按另外程序进行。,大肠菌群阳性反应,乳糖胆盐发酵管,产酸产气现象,分离培养,将产酸产气的发酵管培养物分别划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置(361)温箱内培养18-24h，挑取典型的菌落，并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。,分离培养,伊红美蓝琼脂
5、平板（EMB）：伊红和美蓝染料作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，这两种染料结合成复合物，使大肠菌群产生特征性菌落：a 深紫黑色，有金属光泽；b 紫黑色、不带或略带金属光泽；c 淡紫红色、中心颜色较深。,伊红美蓝琼脂平板,特征性菌落,乳糖复发酵试验（证实试验）,目的：证明从乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产酸产气。,乳糖复发酵试验（证实试验）,在伊红美蓝琼脂平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-3个进行革兰氏染色。同时接种乳糖发酵管，置(361)温箱内培养(242)h，观察产气情况。,乳糖复发酵试验（证实试验）,作用机理同乳糖初发酵试验凡乳糖发酵管产
6、酸产气、革兰氏染色阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色阳性，即报告为大肠菌群阴性。,报告,根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN的检索表，报告每100mL(g)食品中大肠菌群的最可能数(MPN)。,大肠菌群最可能数(MPN)检索表,大肠菌群最可能数(MPN)检索表（续）,说明,本表采用3个稀释度：1mL(g) 、0.1mL(g) 0.01mL(g)，每稀释度3管；表内所列检样量如改用10mL(g) 、1mL(g)、0.1mL(g)，表内数字应相应降低10倍；如改用0.1mL(g) 、0.01mL(g) 0.001mL(g)，表内数字相应增加10倍；依此类推。,实验样品及要求,检测食品：纯奶稀释度：1:1、1:10、1:100稀释液,结论, 加入纯奶1:1、1:10、1:100稀释液的乳糖胆盐发酵管阳性管数分别为0、1、1，查大肠菌群MPN检索表所检测的消毒乳中大肠菌群MPN为60个/100mL产品不合格。,
