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1、蛋白质层析技术,蛋白质层析介质 蛋白质层析技术 蛋白分离纯化平台 及单抗的分离纯化,蛋白质层析的原理和要点,层析的概念,流动相,固定相,C流出组份123,1,2,3,洗脱峰,层析一般地是一种物理方法,层析的热力学分析：分配; 吸附等温线；吸附-脱附（解吸附，洗脱）；线性和非线性过程层析的动力学分析：塔板理论（板高方程）层析是最强有力的分离手段,液相层析,生化分离技术，基因工程技术和免疫学技术并称为生物技术（Biotechnology）液相层析是生物大分子分离纯化的最重要手段,蛋白液相层析的应用,已知和未知蛋白质的纯化结构、动力学、药物作用靶点研究对高纯蛋白的需要免疫学研究及酶免检测抗体抗原的制
2、备基因工程药物生产基因治疗对大量质粒的需要,蛋白液相层析的构成,分析型层析柱和制备型层析柱分析层析：上样量在吸附等温线的前至中段的线性范围中，可以快速定量分析样品，建立纯化方法制备层析：上样量在吸附等温线的中至后段的非线性范围中，不同组分间的相互作用不可忽略，大量纯化样品获得蛋白产物层析仪蛋白分析和纯化实现的设备,蛋白液相层析的一般程序,样品处理选择分离机制建立初步纯化流程流程优化放大Polishing(精细纯化),样品制备,一般性处理去处颗粒物5 m、2 m、0.45 m分级过滤，0.2 m除菌蛋白样品的富集和浓缩脱气纯化过程中样品处理脱盐和缓冲液交换去污剂的去除离子污染物的去除其它的处理和
3、浓缩,分离纯化机制,Charged Groups (asp, glu, lys, arg, his) Ion Exchange and Chromatofocusing,HydroxyapatiteElectrostaticCoordination complexes- Repulsion-Geometric charge distribution-,Size and ShapeGel Filtration,Binding SiteBiospecific Affinity Chromatography,Hydrophobic Region (phe, trp, ile, leu, val, g
4、ly, ala, tyr) Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC),Thiol Groups (cys) Covalent Chromatography,蛋白质层析介质基体须具备的特性,生物兼容性：亲水性，大孔径.不会使生物大分子失活，没 有生物化学毒性：过强吸附，泄漏，氧化还原性化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的. pH,络合物,巯基化合物必要的机械性能: 流体中的耐压性,结构:典型层析介质的放大观察,下图:2%agarose gel 白 线段: 500nm右图:Sephacryl S-500 右上:白线段 10um 右下:白线
5、段0.5um,化学组成:亲水多孔高聚物等,天然高分子多糖:纤维素,交联葡聚糖,琼脂糖及共聚物-孔径分布宽,较软合成高聚物:聚丙烯酰氨类,聚丙烯酸脂类,聚乙二醇聚丙烯酸脂共聚物,亲水性处理的聚苯烯类无机化合物: 硅胶, 羟基磷灰石, 氧化锆,聚合物基体(matrix)孔的结构,孔径分布:分配层析要求分布宽,均匀,相应于低交联度高交联度导致孔径分布偏向高,介质本身微观不均匀性变大,适合大孔径高硬度吸附层析,孔的结构可分为三种类型,标志产品: SepharoseHP，Toyopearl；MacroPrep，UNOSphere，SOURCE；UNOQ，POROS,基体孔结构决定传质特点,孔结构决定扩散
6、速率：孔的开放性越大，扩散越快，对层析的流速越不敏感；反之亦反,动态载量（Dynamic Capacity）,动态载量是制备层析的重要概念：层析过程是偏离平衡态的，流速越大，偏离越远，反之亦反动态载量是制备层析介质的重要性能指标，更快更高是人类活动的重要目标,层析介质颗粒度与动态载量,小颗粒传质更迅速，动态载量更高IgG1在不同颗粒度的Bio-Rad陶瓷性羟基磷灰石上的动态载量比较Buffer-0.05M MES,pH6.5; Flow rate: 600cm/hr,吸附动力学与动态载量,长程作用（库仑力）比短程作用（疏水相互作用）受流速影响小些；粘度与动态栽量负相关,从动态载量看上样条件,B
7、SA在阴离子交换介质上的动态载量：吸附量对洗脱剂的非线性：动态载量对洗脱剂强度远比对其洗脱体积敏感,吸附蛋白的大小与动态载量,层析介质表面吸附功能基团的密度大大超过实际用来吸附蛋白的量小分子对层析介质表面吸附功能基团的密度更加敏感,柱效依赖于层析介质对样品的选择性和分离带宽.在多孔颗粒介质的柱子中带宽或柱效表示为：H =2d+B/V+Cmd2V + Csd2V,d=层析介质离子直径=填充不规则因子H = Plate height塔板高度或柱效A = Eddy diffusion涡流扩散B = Longitudinal molecular diffusion径向扩散(可忽略) Cm = non-
8、equilibrium mass transfer in the mobile phase流动相非平衡物质转移Cs = non-equilibrium mass transfer in the stationary phase固定相非平衡物质转移（显著影响）V = Eluent velocity洗脱速度,影响分辨率的因素,柱效 (H) vs 流速(V),H,V (flow rate),eddy diffusion,longitudinal diffusion,Non-equilibrium mass transfer,Resulting chromatographic behavior,塔板高
9、度 分辩率,不同吸附机制的洗脱峰宽与流速,BSA在同样尺寸层析柱,同样基质颗粒度,同样上样量结论:影响峰宽的因素还有-溶液粘度,洗脱动力学;在其它相同的情况下,离子交换层析比疏水层析的分辩率要高一些,1) Thyroglobulin 2) Gamma-globulin 3) Beta-globulin 4) Cytochrome C,50-100 m UNOsphere,30-60 mMacro-Prep 50,20-40 mMacro-prep 25,10 mBio-ScaleUNO,选用高分辨率预装柱进行分析和工艺优化，然后逐级放大,分析5-10 m beads1-20 ml column
10、sHigh operating pressures, (80 psi)半制备20-30 m beads20-500 mlMedium operating pressures (30-100 psi)制备型层析40-200 m beads20 ml-1000 litersLow to medium operating pressures (5-50 psi),规模：分析还是制备？,分离机制选用策略,各种机制交替试用、相互衔接、补充,分步洗脱还是梯度洗脱？,几步完成纯化？,综合考虑样品的各种性质,Product PropertiesStabilityCharge at different pHHy
11、drophobicityMolecular SizeEssential co-factors,Feed PropertiesCritical impuritiesProduct concentrationIntroduced contaminantsFinal Product specificationsPurityCost per unitLot size,设计合理的方案,Separation Chemistry,Method Scouting,Chemical Stability (lifetime, hygiene) Productivity,Purity, Final Scale, E
12、conomics,Chromatography media with required process performance,Base Matrix,Bead Size,IgG样品中蛋白酶的降解作用,目标产物IgG中残存蛋白酶的降解作用对pH有很强的依赖性蛋白酶作用量:用每克IgG中被消化的IgG的毫克数来表示,阳离子交换与DNA污染,某阳离子交换层析用于早期步骤分离一株小鼠IgM阴影为测得的IgM折线表示的DNA含量范围10exp6-10exp10,同样的起始样品不同的纯化方案,R:含目标IgM的起始粗提物方案A:两步离子交换最后一步低离子强度下分子排阻方案B:疏水层析,阴离子交换,最后高
13、离子强度下分子排阻,生物大分子液相层析仪,蛋白质液相层析有其特殊性-生物相容性和化学稳定性对层析仪有与小分子物质液相层析不同的要求液相层析仪已是非常成熟的设备,层析仪是实现蛋白分析纯化的场所,液相层析仪的基本结构,输液泵注射泵,输液泵恒压泵,输液泵双柱塞泵,不同泵的输液特性,单柱塞泵输液脉冲性较大双柱塞泵，可实现均匀输送双柱塞二元梯度泵是最精密的输液装置,液相层析仪的特性,对于保留值相差较大的物质的分离，最有效的方法的是梯度洗脱蛋白质液相层析使用二元梯度所谓四元梯度，仅限于小分子化合物的分析,二元梯度,四元梯度,层析仪的核心是输液泵,双元梯度可实现高压混合为了保证重现性，液相层析仪使用恒流泵用
14、于分析应保证0.01ml/min的流速精度和梯度精度，3000psi以上的高压40ml/min的流速可运行500ml的离子交换柱，纯化量可以达到克级,更换泵头技术,任何泵的流量范围都很有限更换泵头技术是扩大流量范围的最优性价比的方案该技术在Bio-Rad DuoFlow蛋白层析仪上实现泵的消耗费用很低，只需更换密封垫圈,F10,F40,单柱塞单泵低压混合Waters 650系列双柱塞单泵低压混合BioCAD单柱塞双泵高压混合Gilson，Beckman双柱塞双泵高压混合HP, Bio-Rad, APB AKTA,泵决定了层析仪的特性,检测器,蛋白质液相层析对检测器的要求较简单，多波长检测使用机
15、会较少，而电导检测必不可少（2M (NH4) 2SO4 230ms/cm）其它如pH检测器、折光检测器、荧光检测器、液质联用检测器的消耗费用是层析仪中最昂贵的（灯的更换、光栅的维护）,目前常见的几种检测器,三波长检测器,电导检测器,UV/PH/电导检测器,AKTA,DuoFLow检测器,UV检测器,PH检测器,四波长检测器,高集成度的仪器有利于减少扩散，提高性能,分部收集器,多种收集架可供选择,BioFrac Fraction Collector Optional Rack,用各种阀提高自动化程度,Make-before-break 高压阀 AVR7-3 高压上样阀AVR9-8 高压阀，溶液转
16、向各种低压阀SV5-4低压阀，缓冲液选择SVT3-2低压阀，溶液选择或转向灵活应用各种阀和辅助泵构建随意层析系统,软 件,功能控制硬件、编程控制分析纯化过程、数据分析和管理、用户管理友好程度直观、易学易用,Trace Compare Overlay,几种蛋白层析仪的综合比较,List Price,Performance,高集成、模块化、高灵活性是仪器先进性的体现和发展趋势,有关蛋白层析仪的几种错误观念,蛋白层析与HPLC(不锈钢材质，耐强有机溶剂，不耐酸，Cl- ，EDTA等螯合离子，盐等蛋白纯化试剂）。层析柱或层析介质是层析分离实现的场所，现代蛋白液性层析仪兼容所有蛋白层析介质，不存在所谓“
17、有利发挥介质特性的层析仪” 。工艺移植和同一介质的不同粒度有关，一般和仪器无关，除非仪器集成度不高，死体积太大。很多功能是竞争的产物，非必要，更非业界标准。,蛋白质纯化平台,分子生物学实验室的层析姜韬,引言,现代生物学研究的发展，为分子生物学实验带来新的课题和挑战。目标的功能研究其中相当的工作需要分离纯化表达了的基因产物目的蛋白。研究其活性并制备抗体进行更深入的功能探讨。生物技术的发展，特别是以液相层析为核心的生化分离技术的日益成熟和完善为分子生物学实验室提供了这种充分的条件。,生物技术(Biotechnology)有三大部分：生化分离技术；DNA重组及基因转移技术；免疫检测技术。其中生化分离
18、技术是生物技术的基础和支柱。层析(chromatography)是最有效的分离手段，也是最重要的蛋白质纯化工具。层析主要是物理方法，是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。基因工程下游的核心是层析。层析技术的理论与实践已高度发展和完善。,蛋白质纯化平台将成为分子生物学实验室的基本内容,分子生物学家运用的分离纯化技术具有平台的特征,生化学家分离未知蛋白,规模较小，目标蛋白含量往往极低；各步骤用活性分析和蛋白分析严密监控；针对性强，过程复杂，不可移植；产物纯度要求高，往往用于测序。,基因工程下游分离已知蛋白,规模较大，目标产物含量较高；重视纯化过程的技术经济指标；有较强的针对性，移植性很差；产物纯度要
19、求高，通常有特殊要求： 无病毒，无DNA，无内毒素。,分子生物学实验室需分离已知蛋白,规模小；目标蛋白含量较高，往往是高表达的产物，往往大于5%；纯度和回收率往往要求较低，电泳纯；步骤少，硬件结构有通用性。,蛋白质纯化平台的结构和组成,含量较高的蛋白质纯化，基本可以在三个层析步骤中实现。利用目标蛋白的三个独立的物理化学性质进行层析分离。,分离机制,分子的大小-凝胶过滤(size-exclusion)（分子筛，分子排阻）分子的电性-离子交换（IEC）阳离子交换、阴离子交换分子的表面疏水结构-疏水层析（HIC） 其它：羟基磷灰石，反相，金属螯合(IMAC)，亲和，染料配基介质层析精制（polish
20、ing）：高分辨率层析,纯化平台的硬件结构,中心设备：中压至高压层析仪辅助设备：过滤装置，超滤装置，离心机，蛋白质电泳等,层析柱,不同性能的层析柱；层析柱装填：（1）均匀；（2）紧密柱效评价：理论塔板 板高 不同粒度近似关系为：Hdp2在装填良好的情况下，通常：凝胶过滤 H 2dp； 离子交换、疏水H 3 dp,经验：具有3000个理论塔板的凝胶过滤可近似地将分子量相当2倍的蛋白质完全分开；6000个理论塔板可分开相差1.5倍分子量的蛋白。通常，3000个塔板如用Bio-Gel P(fine)或Bio-Gel A(fine)，流速20cm/h（参照产品说明书） 应在80cm以上至120cm，上
21、样5%，一般1-2%。Scope建议： 柱直径：D=(M/10)1/3 D:cm； M:蛋白量（mg） 而L=30D L：cm,实验室规模的层析应采用不大于50m的离子交换或疏水介质，应具有10cm左右，则不少于600个理论塔板。精制：高效预装柱1- 5ml，10m左右粒度，如Mono系列；Bio-Scale；TSK等。,平台的操作（软件：知识结构）,样品处理及准备工作用SDS-PAGE监测整个流程富含目标蛋白的提取物的获得：应采用尽量低强度的抽提方法。通常PBS或TBS抽提能力过强，没有必要.低渗更有利于破碎，甚至可用水进行抽提（如1：4左右）。无特殊理由，pH应准确控制在中性附近，尽量用酸
22、性buffer；最好运用（NH4）2SO4沉淀，缩小体积，便于保存。终止生化代谢反应，除糖、脂类。个别情形中会造成不可逆沉淀；,E.Coli表达产物的抽提以渗透冲击法为宜，没有特殊原因不要使用超声破碎法。0C ，20%蔗糖，10mM左右缓冲液，含2.5mMEDTA高渗后，加入低渗液，迅速充分悬浮。如果必要，应含DTT至2mM左右。均浆液组成原则：离子强度尽量低：50mM，有时需DTT，不一定加EDTA，可考虑加PMSF，但此时不宜用Tris等胺类缓冲剂。,样品通常特点及对后续纯化的影响,大多数蛋白将带负电荷，样品会含一定量核酸；（NH4）2SO4 沉淀，通常蛋白浓度1- mg/ml ；运行层析
23、，则蛋白浓度不应大于mg/ml。,通常纯化流程：选择性、分辨率、载量,目标蛋白为碱性蛋白，在中性附近运用阳离子交换，选择性好，除核酸 多糖；目标蛋白为酸性蛋白，则第一步层析采用分子筛，最好此前将溶液脱盐，并在含.-.M NaCl的缓冲液中运行，缓冲成分视下一步而定。如果介质含聚丙烯酰胺，则应含Tris 等含氮的缓冲成分，减少-互相作用造成的吸附.,离子交换后，采用疏水层析，可省去缓冲液交换步骤（Buffer Exchange）；如有必要，浓缩后，Buffer Exchange，进行精制。离子交换：平衡液应采用尽量低的离子强度，上样体积不限。,H：阳离子通常低于pI 一个pH单位 阴离子通常高于
24、pI 一个pH单位Sticky protein：在某pH附近，与阳离子和阴离子层析介质都结合。参数获得.上样体积运行离子交换及疏水，样品不需平衡。,实例及分析,从阳离子交换入手 凝胶过滤，疏水从凝胶过滤入手 疏水，离子交换亲和层析不一定必要,从凝胶过滤入手 离子交换,hpag4蛋白分子量约180kD，pI约5，粗提物中含量约5%；粗提物主要特性：I约0.05；pH约7.3；蛋白含量20mg/ml，含少量RNA和 endotoxin。,Size-exclusion,Sample format: desolved 50%(NH4)2SO4 precipitatePurification facto
25、r: 8.8,Anion exchange,Sample format: ultrfiltration concentrated and desulted target fractionPurification factor: 2.9,从阳离子交换入手 凝胶过滤，疏水,Cation Exchange,Sample format: 的olved and desulted 50%(NH4)2SO4 precipitatePurification factor: 13,Size Exclusion,Purification factor:2.4,Purification factor:1.3,Pol
26、ishing,FABP,Affinity chromatography may be not necessary,GST forms multipeaks,Sample format: desulted target fraction of former step,Sample format: desulted 40-80% (NH4)2SO4 (with 2mMDTT) fraction,Native GST is dominant,Sample format: desulted target fraction of former step,致谢,博士生杨领海参与全部实验工作，并引用其论文部
27、分结果。任金琪同学参与部分工作。,单克隆抗体的纯化（纲要）,姜韬,单克隆抗体的生产是最大的生物工程行业，也是制备规模的层析技术最大的使用行业。,单克隆抗体的生产已成为相当成熟的行业（FDA认证）,上游：（小鼠）杂交瘤的制备，筛选，培养及生产已非常完善。 含血清培养基 无血清培养基下游：单克隆抗体纯化平台已实现 无论单抗是否产生于含血清的培养基，都可在两步层析后得到足够纯度和活性回收，但效益不同。,抗体分子的三维结构已测定,抗体分子是较大的球蛋白,单克隆抗体纯化的必要知识及理论准备已很充分,抗体的分子结构和重要理化特性已很清楚抗体分子大小：IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等。抗体的电性：以
28、pI为弱碱为多。抗体的疏水性：血清中最疏水的蛋白质种类之一.特异亲和性：对抗原、Protein A 和 Protein G等.对金属离子的强螯和性：IgG类。溶解性：如低离子强度下的低溶解度(Euglobulin)：IgM类。其他特性：如不同pH下稳定性；又如Cryoglobulin：2%IgG、20%IgM。,沉淀法的应用,盐析:(NH4)2SO4,K2HPO4,Na2SO4,citrate.正辛酸（octanoic acid）沉淀杂蛋白，对高pI的单抗效果更好。PEG沉淀。Ethacridine沉淀杂蛋白，对高pI的单抗效果更好。低盐沉淀:仅限于IgM类。,分子排阻层析,分离选择性有限，通
29、常限于IgM类。,离子交换,最重要的单抗纯化工具：阳离子交换通常比阴离子交换效果更好；抗体正电性变异更大，因而是最有力的去除非特异抗体的方法。运用阳离子交换时，可采用低pH杀病毒。可能要克服的困难： 阳离子交换：低pH下抗体的沉淀 阴离子交换：高pH下蛋白酶的激活,羟基磷灰石层析,效果与离子交换相当，价格较昂，特别有利于去除DNA，Endotoxin和病毒。但最好先去除Albumin.通常以pH6.0-6.5上样。,羟基磷灰石的独特选择性,羟基磷灰石的独特选择性在于：载体基质表面的钙对蛋白质表面的相近羧基的络合作用这种络合作用在pH6.2附近最大,磷酸盐是强有力的洗脱剂,BSA在不同pH的Go
30、ods Buffer 上样,洗脱的分析 洗脱液中磷酸根的络合性和离子交换性都有贡献,上样液中要避免含磷酸盐,IgG在不同磷酸浓度下上样的动态载量pH 6.8,可在较高离子强度下上样,上样: IgG 10mg/ml,50mM MES,pH 6.5,不同浓度NaCl,在pH6.5 的MES中有很高的载量,陶瓷型羟基磷灰石具有优良的动态载量,典型分离层析结果,含单抗IgG腹水水样品在陶瓷型羟基磷灰石柱上的分析结果抗体可以与Transferrin完全分离,与Albumin分离良好,疏水相互作用层析,须采用疏水性很弱的配基；效果很好，完全除去Albumin及Transferrin，去除DNA效果优于离子
31、交换；抗体通常在最后被洗脱，载量高。,金属螯合柱层析,依赖IgG上的His Cluster，效果很好；是条件最温和的吸附层析，最有利于活性保持；要防止金属离子的泄漏。,Protein A和Protein G层析,主要依赖IgG上的His Cluster；单步纯化效果很好；抗体构象变化可能较严重；要解决配基的泄漏。,特殊高选择性介质,如thiophilic adsorption chromatography：采用含硫和吡啶的配基；主要问题：疏水性可能太强，不易保证活性回收。,几种成熟方案及效果评价之一,先以正辛酸沉淀杂蛋白，再用(NH4)2SO4沉淀抗体适用于：大多数IgG和IgY，部分IgA
32、和IgM；总抗体纯度:90% 特异抗体纯度:70-90% 特异单抗回收率:50-80% 比活保持:100%,几种成熟方案及效果评价之二,先以Ethacridine沉淀杂蛋白，再接分子排阻层析 适用于：大多数IgG和IgY 总抗体纯度:90% 单抗纯度:70-90% 单抗回收:60-80% 比活保持:100%,几种成熟方案及效果评价之三,先用(NH4)2SO4沉淀抗体，再用阴离子交换层析 适用于:所有抗体类型 总抗体纯度:90% 单抗纯度:90% 单抗回收:50-70% 比活保持:100%,几种成熟方案及效果评价之四,先用PEG沉淀抗体，再接对优球蛋白(Euglobulin)的吸附-解吸 适用于
33、:大多数IgM 总抗体纯度:90% 单抗纯度90% 单抗回收:50-80% 比活保持:100%,几种成熟方案及效果评价之五,IMAC再接疏水相互作用层析适用于:大多数IgG总抗体纯度:90%单抗纯度90%单抗回收:80-90% 比活保持:100%,几种成熟方案及效果评价之六,Protein A亲和层析再接阳离子交换层析 适用于:大多数IgG,部分IgM 和IgA，不能用 于大鼠IgG2a总抗体纯度:90% 单抗纯度:90% 单抗回收:70-80% 比活保持:80-100%,几种成熟方案及效果评价之七,离子交换层析结合疏水相互作用层析 适用于：所有类型单抗 总抗体纯度:90% 单抗纯度:95% 单抗回收:70-80% 比活保持:100%,层析技术攻关,参见 介质评价及选择；载量的充分利用；合理经济的流程；层析参数的优化.,Steps in Monoclonal AntibodyPurification Process Development,Initial chromatography screening Gradient optimization Preliminary process evaluation Intermediate scale-up Final scale-up and implementation,
