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1、,病毒包装与感染,病毒包装与感染,基因载体系统,病毒载体系统,非病毒载体系统,腺病毒载体,逆转录病毒载体,腺相关病毒载体,单纯疱疹病毒载体,慢病毒载体,裸DNA,DNA-阳离子脂质复合物,DNA-蛋白质复合物,细胞内包装,细胞外包装,DNA-阳离子多聚物,DNA/RNA嵌合物,基因载体系统病毒载体系统非病毒载体系统腺病毒载体逆转录病毒,基本概念：即病毒载体介导基因技术，一种高效的基因转移工具，将外源基因包装到天然病毒的外壳中，利用病毒对宿主细胞的感染性，将外源基因导入特定细胞中，广泛应用于基因诊断和基因治疗。,病毒载体系统,基本概念：即病毒载体介导基因技术，一种高效的基因转移工具，将,病毒载体
2、的优势,利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；病毒的宿主范围广，且具有高效的靶向特异性；病毒基因组的结构简单、分子背景比较清楚，稳定易于改造、易于制备；复杂的装配过程由细胞完成；不同的病毒载体具有不同的表达特点；通过载体改造的方式形成了复制缺陷型结构，安全性高；病毒包装技术经历了多年的研究，已趋于成熟，可用于产业化大量生产,病毒载体的优势利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；,存在的问题,1、安全性：细胞毒性 染色体毒性 免疫毒性2、靶向性：转导靶向性 转录靶向性3、有效性：转导效率 基因表达水平和持续时间 表达的可调控性,存在的问题1、安全性：细胞毒性,要求：1、携带外源基因并能包装
3、成感染性病毒颗粒 2、介导外源基因转移和表达 3、对机体不致病组成：1、病毒复制和包装元件 2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外壳/外膜,要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒,常用的病毒载体：腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病毒的外壳/外膜和感染性，但不表达病毒蛋白,常用的病毒载体：,腺病毒载体慢病毒载体逆转录病毒载体病毒基因组成双链DNA单,腺病毒载体慢病毒载体逆转录病毒载体免疫原性高免疫原性低免疫,腺病毒载体,无包膜的线状双链DNA病毒，宿主范围很
4、广，适用于在分裂或非分裂哺乳动物细胞中进行高效瞬时表达。除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞，腺病毒系统可以在任何哺乳动物细胞中高效瞬时表达，是可靠的基因递送平台。它在感染宿主细胞时，病毒基因组及其携带的外源基因独立于宿主基因组外游离表达，因此是无插入突变性，安全性高。腺病毒载体的外源基因装载量较大，表达速度快，可获得高滴度的病毒。可产生108 pfu/ml原液，浓缩后可达1010-1011VP/ml ，被广泛应用于基础研究和基因治疗中。,腺病毒载体 无包膜的线状双链DNA病毒，宿主范围很广，适用于,腺病毒系统的包装,目的基因克隆至腺病毒穿梭质粒（Pshuttle-CMV）将穿梭质粒线性化后与腺病
5、毒质粒共转入特定的大肠杆菌中通过Cre/loxP系统的作用进行同源重组，产生重组腺病毒颗粒。将筛选到的重组腺病毒运用脂质体法转染到293细胞中，利用带有E1 基因的293 细胞作为包装细胞，一至两周即可包装出E1缺失的腺病毒载体，通过倍比扩增，富集病毒颗粒。,腺病毒系统的包装目的基因克隆至腺病毒穿梭质粒（Pshuttl,慢病毒载体,慢病毒(lentivirus)属于逆转录病毒科(Retrovidae)，为RNA 病毒。慢病毒核蛋白质前整合复合物具有嗜核特性，病毒基因组通过顺式作用元件运输至细胞核，并将要表达的基因序列整合到细胞的基因组中，从而使慢病毒可以感染并在非有丝分裂细胞中复制,得到持续稳
6、定的高表达。这一特性使慢病毒成为基因治疗的转移载体。,慢病毒载体慢病毒(lentivirus)属于逆转录病毒科(R,慢病毒载体的特性,慢病毒载体由慢病毒为骨架改造而来可以高效率将目的基因整合到宿主细胞的染色体上可以感染分裂细胞和非分裂细胞是理想的可以在多种细胞类型（如原代细胞、干细胞和非分裂细胞）中实现可重复的稳定表达的基因表达工具,慢病毒载体的特性慢病毒载体由慢病毒为骨架改造而来,常见的慢病毒包括人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)、猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus, SIV)、马传染性贫血病毒（Equ
7、ine infectious anemia virus,EIAV ）和猫免疫缺陷病毒（Feline immunodeficiency virus,FIV ）。,常见的慢病毒包括人免疫缺陷病毒(Human immunod,HIV-1,HIV-1为单链RNA病毒，共有9个基因。gag、pol、env3个基因编码病毒的基本结构，tat、rev为调节基因，vif、vpr、vpu、nef 4个为辅助基因，编码的蛋白则作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染。,gag -群抗原基因，编码核心蛋白基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白等 pol -多聚酶基因，编码病毒复制所需的酶，如反转录酶、整合酶、蛋白酶 env -
8、包膜蛋白基因，编码包膜蛋白gp120 及gp41，决定病毒感染宿主的靶向性 tat -基因反式激活因子，参与HIV-1基因RNA转录的控制 rev - 病毒蛋白表达调节因子，能增加gag和env基因对结构蛋白的表达 vif -病毒感染因子, 其作用是在一些细胞因子的协下促进HIV-1在细胞内复 Vpr -R蛋白能使HIV在巨噬细胞中增殖 vpu -U蛋白，能促进HIV从细胞膜上释放 nef -负因子，具有抑制HIV-1增殖作用 LTR -两端长末端重复序列，内含复制所需的顺式作用元件，如包装信号元件。,HIV-1HIV-1为单链RNA病毒，共有9个基因。gag、,慢病毒载体系统组成,第一代慢病
9、毒载体系统是以三质粒系统为代表。该系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。包装部分HIV-1前病毒基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用元件, 5端LTR由巨细胞病毒早期启动子取代，3LTR由SV40 polyA序列取代。,包装载体,慢病毒载体系统组成第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表。,表达载体部分与包装成分互补,仅含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作用元件, 5端LTR和全部5端非翻译区域。包膜表达质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用来代替了原病毒的env基因。,表达载体,包膜载体,表达载体部分与包装成分互补,仅含有包装、逆转录和整合所需的H,三代
10、慢病毒载体,第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进在包装质粒中删除了HIV的所有辅助基因（vif、vpr、vpu和nef）不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性第三代慢病毒载体系统由四质粒代替原有的三质粒包装系统。将rev基因单独放在一个包装质粒上。增加了两个安全特性：一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3LTR，使载体失去HIV-1增强子及启动子序列；二是去除了tat基因，用异源启动子序列代替，只保留了3个基因(gag、pol和rev)，更加安全。,三代慢病毒载体第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进,lentivirus 包装流程,将293T 细胞传代
11、至60%70%汇合时，用脂质体法将4 个质粒共转染至细胞。 体外培养24 小时，荧光显微镜下观察，大量细胞表达绿色荧光蛋白，说明质粒转染成功。 培养48小时后，用超速离心收获含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。并进行感染293T 细胞的实验，感染4872 小时后观察到约有70%细胞表达绿色荧光蛋白，说明病毒用很强的感染能力。 将被感染细胞传代1、2 和3次，在传代细胞中依然观察到绿色荧光蛋白的表达，说明包装的慢病毒具备感染和稳定转化宿主细胞的能力。,lentivirus 包装流程 将293T 细胞,逆转录病毒载体,逆转录病毒即反转录病毒是一类RNA病毒，它能在逆转录酶的作
12、用下将RNA反转录为cDNA，再经过DNA复制/转录/翻译等蛋白酶作用扩增形成病毒。逆转录病毒的DNA基因组整合在宿主染色体上的位点是随机的。逆转录病毒DNA的整合是复制病毒RNA的必经阶段。只有当受感染细胞处于细胞分裂期间，逆转录病毒DNA基因组才能接触到宿主细胞的遗传物质。因此，逆转录病毒只能在分裂中的细胞内复制。,逆转录病毒载体逆转录病毒即反转录病毒是一类RNA病毒，它能在,逆转录病毒载体的特点,优点：转染范围广，由于逆转录病毒的受体分布广泛，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等; 转入的外源基因可完全稳定整合到宿主细胞染色体内，使得目的基因长期稳定表达；对细胞感染率高感染
13、细胞不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因。局限性：只能感染分裂细胞；能够插入的外源基因较小，难以满足较大基因的转移；载体DNA整合人宿主染色体是随机的，并因随机整合使原癌基因激活或抑癌基因失活，从而具有引发癌症的风险；活体直接基因转移对病毒滴度要求高，病毒活体直接注射会受到补体影响而灭活等问题。,逆转录病毒载体的特点优点：,逆转录病毒的亲嗜性存在物种之间的差异，据此可将其分为三类：单嗜性逆转录病毒（ectropic retrovirus），只感染小鼠和少数几个品种的大鼠兼嗜性逆转录病毒（amphotropic retrovius），能感染小鼠的细胞，也能感染其他种属动物的细胞异嗜性逆转
14、录病毒（xenotropic retrovirus），能感染多种动物细胞，但不能感染小鼠细胞目前使用较多的是兼嗜性逆转录病毒，即以兼嗜性包装细胞包装病毒颗粒。,逆转录病毒的亲嗜性存在物种之间的差异，据此可将其分为三类：,逆转录病毒载体包装原理,早期逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和逆转录病毒表达载体。逆转录病毒载体中去除了病毒颗粒形成所必需的gag，pol和env基因，仅保留了复制和包装信号。通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上。而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白gag、pol和env蛋白。,逆转录病毒载体包装原理早期逆转录病毒载体系统共由两部分组成：,当重组
15、病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配，该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒，保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。,当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和,第一代包装细胞基因组整合了仅缺失包装信号的MLV前病毒基因组，包装的病毒颗粒为单嗜性。将其包膜蛋白env基因换成鼠4070A病毒的双嗜性包膜蛋白，就产生了能分泌双嗜性病毒的包装细胞。但这个细胞系所含的包装结
16、构仅仅缺失信号，只要它们与载体之间发生一次重组，就可以产生有复制能力的野生型病毒，安全性很差。第二代包装细胞前病毒基因组除了包装信号缺失外，5LTR的5端顺序也缺失，病毒剪接供体上游部位进一步缺失，3LTR被SV40的转录终止多聚腺苷酸信号取代。经过这样的改造，包装细胞与载体系列之间的共同顺序只存在于紧接gag起始密码子上游53bp的区域。,第一代包装细胞,这种包装结构与载体结构至少经过二次独立的重组才能形成有复制能力的野生型病毒，使基因治疗的安全性大大提高。但如用早期的载体进行包装，经长期培养后，仍有野生型病毒产生。第三代包装细胞几乎将基因载体和包装细胞间重组产生的野生型病毒完全消除。包装细
17、胞含有二个互补的逆转录病毒基因组，二者均缺失包装信号，且3LTR均被SV40的多聚腺苷酸化信号取代。但其中一个包装结构只含gag和pol基因，另一结构只含有env基因，由二者联合产生的蛋白质供载体包装。这类包装细胞具有更高的安全性。,病毒包装与感染课件,常见的包装细胞系,常见的包装细胞系,目前常用逆转录病毒表达系统的构成： 一个含有目的基因的逆转录病毒表达载体；一个包膜蛋白载体；表达gag/pol 的辅助质粒；以及包装细胞系。表达载体： 去除了野生型病毒颗粒形成所必需的结构基因，其基本结构和特点为：(1) 5LTR为CMV/MSV杂合启动子，缺失一段序列的3LTR作为终止子，不会在体内发生重组
18、；(2) 保留包装信号+序列,促进高滴度病毒产生。；(3) 去除了野生型病毒颗粒形成所必需的结构基因，保证载体使用的安全性；(4) 在目的基因后用内部核糖体进入位点连接抗性基因，可以根据需要选择不同的抗性；(5) 重组病毒基因组的大小不能超过10kb，如果太大则无法包装成病毒。,目前常用逆转录病毒表达系统的构成：,包膜蛋白载体逆转录病毒的宿主范围由病毒颗粒表面的包膜蛋白(Env)决定，病毒基因组不影响其靶向性，不同的基因组可用相同的Env包被，且Env来自何种病毒，包装出的病毒颗粒就叫该病毒的假病毒。逆转录病毒的包膜蛋白如10A1、GAP70和4070A等都不稳定，其与细胞受体的结合部位容易受
19、离心剪切力或其它机械力破坏。此外，由这些包膜蛋白参与组成的逆转录病毒在进入宿主细胞时需要经过一个特异性的受体配体结合过程，由此决定了一种病毒只能感染一种或一类细胞，限制了逆转录病毒表达系统的应用。包膜蛋白常用的载体主要有P10A1、pEco、pAmpo和口炎疱疹病毒-G蛋白（vesicular stomatitis virus G, VSV-G）。,包膜蛋白载体,VSV-G因其具有更广泛的宿主范围和更高的转染效率等优点而成为组成逆转录病毒表达系统的最常用包膜蛋白载体。VSV-G的结构比较简单，在与逆转录病毒载体共转染到包装细胞内之后，VSV-G蛋白瞬时表达，调节病毒通过脂质结合及质膜融合，介导
20、病毒进入细胞，将重组病毒RNA包装成有感染力的病毒。,包膜蛋白载体pVSV-G,VSV-G因其具有更广泛的宿主范围和更高的转染效率等优点而成,当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配，该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。,packing,当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作,逆转录病毒包装流程,逆转录病毒包装流程,1）构建逆转录病毒载体：将目的基因片段连接至逆转录病毒载体；2）包装细胞准备和病毒包装将293T 细胞传代到直径10 mm 培养皿，细胞汇合
21、度达到95%以上时准备转染。转染前1小时将培养皿中的细胞培养液换为不含血清的新鲜DMEM。通过脂质体转染的方法将载体质粒、包膜质粒、包装质粒共转染293T细胞。3）病毒的收集转染后48h后第一次收集病毒上清，72h后再收集一次。 4）病毒的浓缩使用Amicon Ultra-15 centrifugal filter devices (100K NMWL)进行浓缩。直接用于小鼠细胞感染或分装冻存于-80。,1）构建逆转录病毒载体：将目的基因片段连接至逆转录病毒载体；,病毒转染293T细胞荧光检测效果A：体外培养24 h；B,C:4872h；D,E,F：感染细胞传代后1代、2代、3代,病毒转染29
22、3T细胞荧光检测效果,逆转录病毒感染流程：,1）准备待转染的细胞；2） 用含细胞因子的培养基培养细胞，刺激细胞进 入周期，有利于逆转录病毒的感染；3） 收集细胞，与病毒混合接种；4） 培养细胞8-10 h，更换不含病毒液的培养基； 5）继续培养12h后进行二次感染；6）第一次病毒感染72h后收集感染的细胞，进行流式分选。,逆转录病毒感染流程：,病毒滴度的测定,滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。滴度测定有稀释计数法、定量PCR法、抗生素筛选细胞克隆法以及流式细胞对荧光细胞进行直接计数等。常用的是稀释计数法。,病毒滴度的测定 滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生,两种稀释计数法的具体实验方法 在6孔板中铺293T细胞，1 105/孔。按（原液，1:10，1:100，1:1000，1:10000）的方案对病毒进行稀释，将病毒加入孔中继续培养。 1）感染后48小时，收集病毒感染的细胞，用流式细胞仪检测GFP阳性率。按如下公式进行梯度计算：病毒滴度（TU/ml）=GFP+细胞% 第1天接种的293T细胞数 稀释倍数 /第1 孔加入病毒原液体积（ml）。,两种稀释计数法的具体实验方法,
