基因治疗专业知识培训培训课件.ppt

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1、基因治疗专业知识培训,基因治疗专业知识培训,本章，我们讨论4个问题。 1.概述 2.基因治疗的原理 3.基因治疗中外源基因导入技术 4.基因治疗的应用研究,基因治疗专业知识培训,2,本章，我们讨论4个问题。 1,第一节 概 述,基因治疗专业知识培训,3,第一节 概 述基因治疗专业知识培训3,人类疾病的发生，往往涉及到内源基因的突变（如遗传病）和外源基因的入侵（如感染性疾病）。机体对外来侵袭抵御体现在以下4个层次： 1.整体水平，诸如动物的打斗撕咬； 2.细胞水平，如M对“异已”吞噬作用； 3.分子水平，如抗原抗体反应，人可以产生106抗体分子，对付外来侵袭； 4.基因水平，对付外源基因入侵，在

2、原核生物中有一种限制性核酸内切酶可将外源基因水解掉。,基因治疗专业知识培训,4,人类疾病的发生，往往涉及到内源基因的,对于内源基因突变: 至今未找到令人满意的治疗方法。 基因治疗仅仅处于初始阶段。 全世界接受基因治疗者106人，受试者600人,基因治疗专业知识培训,5,对于内源基因突变:基因治疗专业知识培训5,定义：,广义地说，基因治疗是应用基因或基因产物，治疗疾病的一种方法。从狭义地说，基因治疗是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，改善疾病的一种治疗手段。,一、基因治疗的概念,基因治疗是治疗基因突变性疾病的一项根本性措施，同时它为非基因突变性疾病提供了

3、一个新的治疗手段。,基因治疗专业知识培训,6,定义：广义地说，基因治疗是应用基因或基因产物，治疗疾病的一种,二、基因治疗的策略,两个基本策略:,原位矫正病变基因基因取代或基因干预,基因治疗专业知识培训,7,二、基因治疗的策略两个基本策略:原位矫正病变基因基因治疗专业,象外科移植手术，切除病变部分，换上正常健康基因，这在目前还难以做到,(一)原位矫正病变基因(纠正异常碱基),图11-1 镰形红细胞贫血病人的Hb为HbS(由 珠蛋白基因点突变引起),基因治疗专业知识培训,8,象外科移植手术，切除病变部分，换上正常,(二)基因取代或基因干预,基因置换 (gene replacement),通过体内基

4、因同源重组,原位替换病变细胞内的致病基因,基因增补 (gene augmentation),不除去异常基因，向靶细胞导入外源基因通过非定点整合，使其表达产物，从而弥补缺陷基因的功能,基因干预 (gene interference),在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达。包括反义RNA、核酶、三链DNA及干扰RNA技术,基因治疗专业知识培训,9,(二)基因取代或基因干预基因置换 (gene replace,三、基因治疗中的靶细胞,生殖细胞: 优点治本 困难生殖(学)生物学问题，极其复杂且不清楚。 伦理学问题,名人精子库”，“美女卵子库”，总是别人的“种”，不好办，即使这个问题解决，恐怕未必然，

5、爱因斯坦生了个弱智女，马克思后代在开出租车（不是说开出租车不好，特此声明）,基因治疗专业知识培训,10,三、基因治疗中的靶细胞 生殖细胞:名人精子库”,体细胞目前常用体细胞有： 淋巴细胞 骨髓细胞 内皮细胞 皮肤纤维细胞 肝细胞 肌细胞 角化细胞(keratinoyte) 多种肿瘤细胞,附:选择靶细胞依据疾病累及的主要部位。靶细胞来源的难易程度。体外培养的成活率和存活时间。接受正常基因的能力。新的正常基因能否在靶细胞能否 正常表达和持续时间。,基因治疗专业知识培训,11,体细胞目前常用体细胞有：附:选择靶细胞依据基因治疗专业知,四、基因治疗的途径,1.间接体内疗法（ex vivo） 体外将治疗

6、基因靶细胞内,再将经基因修饰靶细胞病人,使这种外源基因(细胞)在体内表达，从而达到基因治疗目的.(目前多采用这种疗法)。2.体内法(in vivo) 外源基因直接导入体内有关组织器官进入相应组织器官进行表达从而达到基因治疗目的。,基因治疗专业知识培训,12,四、基因治疗的途径 1.间接体内疗法（ex vi,基因治疗的 基本原理,第 二 节,基因治疗专业知识培训,13,基因治疗的 基本原理第 二 节基因,基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：,治疗性基因的选择,基因载体的选择 病毒载体 非病毒载体,靶细胞的选择 体细胞 生殖细胞,载体与治疗基因重组及筛选鉴定,将重组DNA导入靶细胞,检测目的

7、基因和标记基因的表达产物,基因治疗专业知识培训,14,基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：治疗性基因的选择基,基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：,基因转移 间接体内疗法 直接体内疗法,转导细胞的筛选与鉴定,回输体内,利用标记基因和目的基因的表达产物利用核酸分子杂交,考核疗效和安全性,基因治疗专业知识培训,15,基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：基因转移,基因工程 基因治疗1. 目的基因 应用或研究基因 标志基因+治疗基因2. 载 体 (原核或真核) (真核)3. 靶 细 胞 原、真核 真 核4. DNA体外重组 5. 重组DNA导入宿主细胞 6. 后处理 ,基因治疗与基因

8、工程的比较,基因治疗专业知识培训,16,第 三 节,基因转移技术,基因治疗专业知识培训,17,第 三 节基因转移技术基因治疗专业知识培训1,生物学方法 非生物学方法逆转录病毒载体 磷酸钙共沉淀法 腺病毒载体 质粒DNA/脂质体法腺相关病毒载体 电击法单纯疱疹病毒载体 受体介导转移法 注射法以逆转录病毒法最为常用，以磷酸钙法最为便宜（经济），以注射法最为简捷，最值得研究和推广应用（笑话，也最危险。）,转移基因方法,基因治疗专业知识培训,18,生物学方法,基因治疗专业知识培训,19,基因治疗专业知识培训19,一.病毒载体转基因的生物学方法,（一）逆转录病毒的生活（命）周期,逆转录病毒载体,（二）逆

9、转录病毒的基因组结构,(三) 逆转录病毒载体结构功能特点,(四) 重组逆转录病毒载体结构,（五）重组逆转录病毒的制备,（六）重组逆转录病毒基因转移系统,（七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题,基因治疗专业知识培训,20,一.病毒载体转基因的生物学方法,1.吸附病毒衣壳糖蛋白与细胞膜受体特异性结合，吸 附在膜受体上。 2.入胞病毒核酸进入host细胞，逆转录，整合到 host DNA 中去，转录、复制 3.病毒颗粒成熟病毒核酸和病毒蛋白装配成成熟 病毒颗粒 4.病毒颗粒的释放释放的子病毒又可感染其它细 胞，每个细胞可以释放105子病毒。,（一）逆转录病毒的生活（命）周期,基因治疗专业知识培

10、训,21,1.吸附病毒衣壳糖蛋白与细胞膜受体特异性结合，吸（,图11-2 Rous肉瘤病毒毒粒结构示意图,基因治疗专业知识培训,22,图11-2 Rous肉瘤病毒毒粒结构示意图基因,1.一般特征(1)正链RNA病毒 即与mRNA极性相同（53），反之为(一)；(2)5有m7Gppp帽，3有poly（A）尾；(3)病毒进入细胞后，经本身逆转录成双链cDNA分子细胞核并整合到宿主染色体,这种整合病毒DNA称为前病毒(provirus)(不管是源于RNA还是DNA)(并非所有逆转录病毒都致癌)。,（二）逆转录病毒的基因组结构,基因治疗专业知识培训,23,1.一般特征（二）逆转录病毒的基因组结构基因治

11、疗专业知识培训,图11-3 逆转录病毒基因组的基本结构,2基因组结构,基因治疗专业知识培训,24,图11-3 逆转录病毒基因组的基本结构 2基,(三) 逆转录病毒载体结构功能特点,保留病毒的LTR ,去除病毒的结构基因,加上一个抗性标记基因,基因治疗专业知识培训,25,(三) 逆转录病毒载体结构功能特点 保留病毒的L,(四) 重组逆转录病毒载体结构,保留病毒的LTR ,用目的基因和抗性标记基因置换了病毒的结构基因,基因治疗专业知识培训,26,(四) 重组逆转录病毒载体结构保留病毒的LTR,常用逆转录病毒载体的结构示意图,基因治疗专业知识培训,27,常用逆转录病毒载体的结构示意图 基因治疗专业知

12、识,（五）重组逆转录病毒的制备,是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成的一种特殊的细胞系，这种细胞因携带有逆转录病毒基因组而大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（序列）而不能包装,不产生病毒颗粒。,1包装细胞,(1)包装细胞定义,基因治疗专业知识培训,28,（五）重组逆转录病毒的制备 是将缺失了包装,为了获得感染能力, 逆转录病毒载体不含病毒的结构基因,不能产生gag、pol、env 野生型MO-MLV可供这些蛋白质，为什么不用野生型MO-MLV？ 包装后会产生大量有复制能力的野生型病毒颗粒，进入体内可能大量复制，具有插入突变危险，特别是插

13、入激活癌基因，灭活抑癌基因危险，不利于治疗用。 所以要设计一种细胞重组逆转录病毒载体只能在其中包装成重组逆转录病毒颗粒（确切的说，只有一次感染能力），但能从中释放出来到靶细胞，这就是包装细胞，不产生复制能力的野生型包装结构。,(2)为什么要包装细胞？,基因治疗专业知识培训,29,为了获得感染能力, 逆转录病毒载体不含病毒的结构基,(3) 三代包装细胞,第一代包装细胞,2细胞系:这种细胞的基因组中整合有仅仅缺失包装信号的MLV前病毒基因组。只要与载体（含）之间有一次重组，就可以产生有复制能力的野生型病毒。,第2代包装细胞,PA317细胞系:含逆转录病毒PAM3基因组，缺失信号及部分5LTR，3L

14、TR被SV40的多聚A化信号取代,与载体至少要经过2次独立的重组才能形成有复制能力的野生型病毒,第3代包装细胞,CRIP: 含2种逆转录病毒基因组,每种不仅缺失信号 ,且仅含病毒的部分结构基因,经过多次独立重组，才能产生有复制能力的野生型病毒,基因治疗专业知识培训,30,(3) 三代包装细胞第一代包装细胞2细胞系:,2重组逆转录病毒的制备,-,基因治疗专业知识培训,31,2重组逆转录病毒的制备 - LTRLTRNe,（六）重组逆转录病毒基因转移系统,1逆转录病毒介导基因转移的靶组织细胞,靶细胞的最基本要求:,细胞表面具有逆转录病毒相应的受体,最常用作基因治疗的靶有：,骨髓干细胞、成纤维细胞、淋

15、巴细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞，还包括所有的肿瘤细胞,基因治疗专业知识培训,32,（六）重组逆转录病毒基因转移系统1逆转录病毒介,2基因转移的方法与途径,ex vivo,分离培养宿主细胞,离体转移基因,效率高，但大多人体组织细胞原代培养比较困难。,in vivo,重组逆转病毒载体直接注射的途径主要有：采用静脉注射途径直接将产生重组逆转录病毒载体的包装细胞注射到组织或肿瘤中直接将表达载体，,基因治疗专业知识培训,33,2基因转移的方法与途径 ex vivo分离培养,3重组逆转录病毒靶向基因转移,重组逆转录病毒前病毒整合位点的靶向性,大多数前病毒的整合作用是随机的，对DNase I超敏区域和

16、转录活化区域的整合是具有优先整合的倾向性。在肿瘤中前病毒优先与细胞原癌基因和染色体脆性位点整合。,通过基因转移的方法与途径限制受感染细胞,ex vivo:被感染的靶细胞被预先选择，细胞靶向性能够很好地实现,in vivo:将重组病毒注射到特定的组织器官或其腔体内，以达到较好的组织细胞选择性基因转移的目的，如进行肿瘤实体内注射，使重组病毒主要感染肿瘤细胞。,基因治疗专业知识培训,34,3重组逆转录病毒靶向基因转移 重组逆转录病毒,病毒感染水平的限制,利用逆转录病毒对人类细胞的某些亚群具有限制性的亲嗜性。如HIV和HTLV-1,基因转录水平的限制,在逆转录病毒载体中导入具有基因表达调节作用的序列利

17、用-甲胎蛋白基因的肝组织特定性调节成分与TK基因相连,基因治疗专业知识培训,35,病毒感染水平的限制 利用逆转录病毒对人类细胞,5LTR,Neo,Ampr,oriE,3LTR,插入外源cDNA,5LTR,Neo,Ampr,oriE,3LTR,cDNA,SLTR,SLTR,转录,g p,e,mRNA,mRNA,病毒蛋白质,包装,完成假病毒颗包装，分泌到包装细胞培养上清液中。,逆转录,感染靶细胞,前病毒,前病毒插入,外源基因,转录,mRNA,翻译,蛋白质,G418筛选,转染包装细胞，转录出RNA,基因治疗专业知识培训,36,5LTRNeoAmproriE3LTR插入外源cDNA,（七）逆转录病毒载

18、体介导基因转移的安全性问题,1产生野生型病毒,存在有复制能力的野生型病毒，主要来源于载体和不含序列的辅助病毒重组成野生型病毒,2逆转录病毒载体插入的破坏性,逆转录病毒载体携带的基因在受体细胞染色体上的基因组合是随机的。与临近基因相互作用,可能激活癌基因，灭活抑癌基因或破坏细胞生长的必需基因。,3污染问题,基因治疗专业知识培训,37,（七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题1,由于病毒的感染性和寄生特性，使现在约85%基因治疗临床项目采用病毒载体。但是病毒载体存在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小，靶向特异性差，制备复杂及费用较高等不足。所以人们愈来愈重视非病毒法的研究。 非病毒载体的本质是

19、将基因治疗中基因看作为药物，然后从药剂和药理学的角度如何把基因导入靶细胞或组织、器官并进行表达。基因作为药物发挥治疗作用的关键问题是导入的靶向性，表达的有效性和可调控性。,二.非病毒载体 转基因的非生物学方法,基因治疗专业知识培训,38,二.非病毒载体 转基因的非生物学方法基因治疗,非病毒载体优缺点,基因治疗专业知识培训,39,非病毒载体优缺点优 点 缺 点1.不需包装细胞,1.方法 用一定比例的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸共溶于氯仿制备成双层磷脂的封闭囊泡超声波处理将待转移外源基因DNA包入制备成脂质体/质粒DNA复合物利用其能与细胞膜融合的特性，可将质粒DNA转入细胞中。 2.优点 脂质体作为

20、载体可以携带各种DNA片段，且在转移途中保护基因不被核酸酶降解。 3.缺点 转移效率低、制备麻烦、商品较贵。,（一）脂质体介导的转移方法,基因治疗专业知识培训,40,1.方法 用一定比例的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸共溶于,1阳离子脂质体,由带正电荷的脂类如四胺基去污剂、胆固醇阳离子衍生物、二酰基甘油和多胺的脂类衍生物和中性辅助脂类如二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）或二油酰基磷脂酰胆碱（DOPC） 等摩尔混合组成。,通过电荷的相互作用，阳性电荷的脂质体和带阴电荷的DNA之间可以有效地形成复合物。由于具有多余的正电荷，复合体可以与细胞膜带负电荷的唾液酸结合，然后通过内吞作用摄取载体复合体。,基因治疗

21、专业知识培训,41,1阳离子脂质体 由带正电荷的脂类如四胺基去污剂,2阴离子（anionic）脂质体,含有磷脂酰丝氨酸或含50%二棕榈磷脂酰甘油,由于磷脂和寡聚核苷酸均带负电荷，必须在脂质体中加入钙离子方可提高包装效率。由阴离子脂质体转运的寡聚核苷酸首先定位细胞核，也延长了寡聚核苷酸在细胞内的保留时间。,阴离子脂类可以置换阳离子脂质/DNA复合体的DNA,基因治疗专业知识培训,42,2阴离子（anionic）脂质体 含有磷脂酰,3pH敏感型脂质体,可由二油酰胆碱（DOPE）、胆固醇和油酸以4：4：2（摩尔比）组成,DOPE决定了脂质体在中性pH条件下的稳定性和酸性条件下与细胞融合的能力,酸性条

22、件下可导致其脂肪酸羧基的质子化而引起六角晶相的形成导致膜融合的发生,基因治疗专业知识培训,43,3pH敏感型脂质体 可由二油酰胆碱（DOPE）,（二）受体介导的基因转移技术,1.方法 利用细胞表面各种特定受体的配基为“导弹头”与多价阳离子聚合物（或能与其它能强烈吸附DNA物质相连接），构成导向性运输载体，通过细胞内吞作用，将目的基因靶向性地移至某种特定细胞内基因转移的方法。2.特点：受体介导内吞作用具有： 1） 细胞组织器官特异性； 2） 转移效率高。3.举例：此法研究较多的是唾液酸糖蛋白与转铁蛋白。 如：利用唾液酸糖蛋白（配体）携带表达载体已成功地将目的基因转移至肝细胞内，获得目的基因表达。

23、,基因治疗专业知识培训,44,（二）受体介导的基因转移技术 1.方法 利用,（三）注射法,1直接注射,将裸露DNA直接注入肌肉内，外源基因在肌肉中的表达量与注入的外源性基因含量成正比，与溶液体积无关。,2显微注射法,采用特别的显微注射器在显微镜下把重组DNA导入靶细胞,显微注射法:在显微镜下将注射器针头穿过细胞膜后刺入细胞核，将重组DNA直接注入受体细胞核中,穿刺法:在显微镜下用显微注射针穿刺细胞膜及核膜，将重组DNA加入细胞培养液中，使细胞周围的重组DNA有机会进入细胞中,基因治疗专业知识培训,45,（三）注射法1直接注射 将裸露DNA直接注入肌,（四）电泳冲介导法（电穿孔法）,是对受体细胞

24、加入高压电脉冲，使细胞上形成许多瞬间小孔，从而使不同细胞之间的原生质发生融合，或使外源DNA通过细胞膜上出现瞬间小孔而进入细胞。,（五）超声介导的转染方法,（六）微粒轰击法,(七)磷酸钙共沉淀法,基因治疗专业知识培训,46,（四）电泳冲介导法（电穿孔法） 是对受体细胞,三、非病毒载体的优化策略,（一）靶向性问题,利用细胞表面特异性表达的受体或蛋白来解决靶向性（targeting）问题,例如:唾液酸糖蛋白（asialo-glycoprotein，ASGP）能与肝细胞上去唾液酸糖蛋白受体特异性结合并介导内吞的特点，将ASGP与携带DNA的多聚阳离子多肽共价结合，证明DNA主要进入肝细胞并能高效表达

25、,靶向性配体主要有单克隆抗体、病毒胞膜蛋白、生长因子或激素等,配体和DNA连接的物质主要有多聚赖氨酸、精蛋白和阳离子脂质体，DNA嵌合剂、DNA抗体等,基因治疗专业知识培训,47,三、非病毒载体的优化策略 （一）靶向性问题,（二）内吞小泡释放（endosome releasing）问题,促进DNA从内吞小泡释放策略：,利用抑制溶酶体的药物、融合型脂类、pH敏感脂质体或有侧链的多聚阳离子和星状树突体等来破坏内吞小泡膜以释放其中的DNA；,通过耦联技术，利用病毒或病毒蛋白、细菌蛋白、短肽等。,基因治疗专业知识培训,48,（二）内吞小泡释放（endosome relea,（三）转运入核问题,SV40

26、的大T抗原的PKKKRKV序列、VP1、肽核酸和聚乙烯亚胺（PEI）可以促进DNA的核转运。,（四）基因及其表达调控问题,通过优化启动子、增强子、内含子、终止序列及密码子的使用来提高载体质粒上靶基因的表达和安全性。入核问题也可属于此范畴。,基因治疗专业知识培训,49,（三）转运入核问题 SV40的大T抗原的,第 四 节,反义RNA、核酶和三链DNA在基因治疗中的应用,基因治疗专业知识培训,50,第 四 节反义RNA、核酶和三链DNA在基因,核酸包括DNA和RNA，都是遗传物质，所以反义核酸可称作反义基因，即能通过互补碱基与DNA或mRNA互补的核酸分子。 反义RNA技术、核酶技术、三链DNA技

27、术，广义地说，这3者可以统称为反义核酸技术，3者之间有一定联系，也有一定的区别。,一.反义核酸的概念,基因治疗专业知识培训,51,核酸包括DNA和RNA，都是遗传物质，所以反义核酸,1.反义RNA（antisense RNA）:与mRNA互补的RNA 。结合时，可阻止mRNA翻译产生蛋白质。2.核酶（ribozyme）：具有催化功能的RNA称为核酶。其与相应mRNA结合后能发挥酶活性，将mRNA降解。3.三链DNA(反义基因)：是人工合成的寡核苷酸（oligodexynucleotide,olgoDT），其进入机体，以胞吞方式进入细胞，可直接结合到DNA双链的特定部位，形成三聚体，影响转录因子

28、结合，使转录过程不能启动。,二.反义核酸用于基因治疗的基本原理,基因治疗专业知识培训,52,二.反义核酸用于基因治疗的基本原理基因治疗专业知识培训52,1）抗肿瘤：就是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达，以期阻断瘤细胞内异常信号的传导，使瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡。2）抗病毒：用反义DNA或反义RNA阻断DNA复制，转录和翻译，从而达到抗病毒目的。,反义核酸在基因治疗中的应用,基因治疗专业知识培训,53,1）抗肿瘤：就是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些异常基因,反义RNA的应用方法有两种 1） 体外合成反义RNA直接作用细胞，细胞吸收后发挥作用； 2） 构建表达质

29、粒，转入细胞，转录出反义RNA发挥作用。,三.反义核酸技术,（一）反义RNA技术,意义:,抑制一些有害基因的表达或失控基因的过度表达,基因治疗专业知识培训,54,反义RNA的应用方法有两种 三.反义核酸技术（一）,解决的首要问题 :,1专一性转移问题,进行基因治疗时，反义RNA必须专一性转移到病变细胞中,2反义RNA进入靶细胞前的降解问题,反义RNA抗RNase的能力不强,受体介导的反义RNA转移技术是解决上述两个问题的一条十分有希望的途径。,基因治疗专业知识培训,55,解决的首要问题 :1专一性转移问题 进行基因治,受体介导反义RNA转移技术,针对上述2个问题人们设计一种反义RNA运载工具，

30、如： ASGP-PL（脱唾液酸血清类粘蛋白一多聚赖氨酸)，能将反义RNA运至肝细胞发挥作用； 利用受体介导反义RNA在抑制c-myc和乙肝病毒基因的表达方面有所研究，基本上克服了上述弱点。,基因治疗专业知识培训,56,受体介导反义RNA转移技术针对上述2个问题人们设,1）安全性高：反义RNA只针对特异的mRNA分子，不改变所调节基因的结构，并且最终在细胞内降解，不留“残渣”。2）设计制备方便：设计复盖5端的反义RNA可以封帽反应（mRNA不能进入核糖体），即可抑制特定基因表达和功能。制备也较简单： 体外转录得到，利用表达载体在体内转录得到3）具有剂量调节效应；4）能直接作用某些RNA病毒；5）

31、发展：设计“抗降解”RNA，可以延长反义RNA寿命；设计“反义RNA+核酶”复合功能体、既有 “封闭”又有“切割”作用。,3.应用前景：,基因治疗专业知识培训,57,1）安全性高：反义RNA只针对特异的mRNA分子，不改变所调,1.核酶设计应考虑的因素 核酶由“两端引导序列+中间保守序列”组成， 引导序列取决于靶序列的碱基组成, 中间保守序列：是酶活性的结构域,酶活性中心包括结合部位和催化中心，,（二）核酶（ribozyme）技术,核酶两端的引导序列与靶RNA分子的序列互补，起着识别和结合底物的作用。,设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域,基因治疗专业知识培训,58,1.核

32、酶设计应考虑的因素（二）核酶（ribozyme）技术,人工设计的核酶,粗线表示合成的核酸分子细线表示天然的核酸分子X 表示一致性序列箭头表示切断点,基因治疗专业知识培训,59,人工设计的核酶粗线表示合成的核酸分子基因治疗专业知识培训59, 化学合成：提供序列顺序，由厂家合成、很方便。 体外转录: a 据靶序列先合成DNA双链； b 将dsDNA克隆到表达载体上； c 利用表达载体转录获得核酶。,2.核酶制备：,基因治疗专业知识培训,60,2.核酶制备：基因治疗专业知识培训60,外源导入：借助脂质体包裹导入细胞内。内源导入：借助逆转录病毒表达载体转染。 导入细胞的同时，分别导入报告基因与反义表达

33、载体（带报告基因）作对照，用以检测载体的表达能力，以区别抑制作用是核酶还是反义RNA。,3.核酶导入细胞的两种方法,基因治疗专业知识培训,61,外源导入：借助脂质体包裹导入细胞内。3.核酶导入细胞的两种方,1.意义:,（三）反义基因(三链DNA)技术,通过形成三链DNA,完全抑制特定基因的表达 。三链DNA被称为“能够攻击病毒和癌细胞而不损害健康组织”的新型基因药物。,2.作用机制:,合成的同聚嘌呤或同聚嘧啶脱氧寡核苷酸（ODN）在一定条件下也可以与双螺旋DNA分子中的同聚嘌呤同聚嘧啶区段结合形成局部的分子间三链DNA,可干扰核蛋白因子或聚合酶与DNA的这一位点结合，因此三链DNA能够在转录水

34、平上抑制基因表达。,基因治疗专业知识培训,62,1.意义:（三）反义基因(三链DNA)技术通过形成三链DNA,3、技术关键:,专一性：针对靶序列设计高度选择性的反义基因；稳定性：通过化学修饰，使反义基因能抵抗体内核酸酶的进攻，延长反义基因的寿命。,摄取及分布:直接通过扩散作用进入细胞内，同时还通过细胞内吞作用入胞 。 ODN的摄取过程是一个依赖于碱基序列长度、活性及饱和的内循环过程。,基因治疗专业知识培训,63,3、技术关键:专一性：针对靶序列设计高度选择性,第 五 节,基因治疗的应用研究,基因治疗专业知识培训,64,第 五 节基因治疗的应用研究 基因治疗专业知,除外伤性疾病外，所有疾病都是遗

35、传因素（内因）与环境因素（外因）相互作用结果。遗传因素起主要作用疾病如：血友病、白化病、苯酮尿 症等；环境因素起主要作用疾病如：传染病、营养性疾病等；二者都起重要作用疾病如：糖尿病、高血压、冠心病、肿瘤、精神分裂症等。 目前发现：单基因病4000多种，多基因病不少于1000种，染色体病100多种，随着传染病与营养性疾病的有效控制和科技经济文化的进一步发展，遗传病患病率有相对上升趋势。,基因治疗专业知识培训,65,除外伤性疾病外，所有疾病都是遗传因素（内因）与环境,（一）3个考虑因素和3个困难：1. 3个考虑因素： 1）对该病有关基因应详尽了解，能在实验中克隆该基因，并能导入真核细胞中表达； 2

36、）只需产生较少量原来缺陷基因表达产物就能矫正疾病； 3）即使导入基因过渡表达，对机体也无不良反应。,一.遗传病的基因治疗,基因治疗专业知识培训,66,（一）3个考虑因素和3个困难：一.遗传病的基因治疗基因治疗专,2.3个困难：,1）导入外源基因调控问题,导入外源基因（治疗基因）接受体内调控系统的统一调控，这在目前难以做到，有待进一步研究。,2）有些遗传病是某些特殊细胞损伤造成的，这些细胞不易取出供体外基因工程操作用,3）单基因遗传病，缺陷只局限于某一个发病的基因，但其造成临床结果往往广泛累及多个脏器,目前只有几种体细胞适用体外基因治疗,基因治疗专业知识培训,67,2.3个困难：1）导入外源基因

37、调控问题 导入外源基因（治,1.腺苷脱氨酶（adenosine deaminse,ADA）催化反应 腺嘌呤脱氧核苷 次黄嘌呤苷次黄嘌呤黄嘌呤尿酸(醇式)(人和猿的终产物)2.ADA缺陷生化代谢障碍及其临床症状 ADA缺陷 腺嘌呤核苷酸代谢受阻dATPT淋巴细胞DNA链不断崩解，同时激活DNA依赖的ADP-核糖聚合酶的活性,降低NAD水平，使蛋白质合成减少细胞死亡，同时也影响B细胞功能。 ADA缺陷常伴有重症联合免疫缺陷（SCID）症状。,ADA,（二）腺苷脱氨酶（ADA）缺陷遗传病的基因治疗,基因治疗专业知识培训,68,1.腺苷脱氨酶（adenosine deaminse,ADA,1）单个核细

38、胞的分离：使用淋巴细胞分层液分离患儿血中单个核细胞； 2）单个核细胞培养：以“OKT3抗体+IL2”刺激体外培养T细胞增殖，分化； 3）逆转录病毒载体介导外源基因转染T细胞； 4）将转染细胞回输给患儿体内。,3.ADA基因治疗方案：,ADA缺陷的基因治疗始于1990年9月14日，治疗对象是1个4岁的美国女孩，方案是：,基因治疗专业知识培训,69,1）单个核细胞的分离：使用淋巴细胞分层液分离患儿,ADA缺陷基因治疗获得了成功，但每间隔35个月，同样的基因治疗操作程序必须同样重新进行。治疗麻烦给病人也增加了痛苦，这是因为淋巴细胞寿命只有几个月时间。研究者正在考虑是否使用寿命较长的靶细胞，当然以骨髓

39、干细胞的转导和回输为好，人们在不断努力。,4.问题,基因治疗专业知识培训,70,ADA缺陷基因治疗获得了成功，但每间隔35个月，同,二.肿瘤的基因治疗,基因治疗专业知识培训,71,二.肿瘤的基因治疗基因治疗专业知识培训71,1.抑制和杀伤肿瘤细胞 1）恢复抑癌基因功能 转染正常抑癌基因于肿瘤细胞，使之表达正常抑癌基因产物，在一定程度上抑制肿瘤的恶性表型，如转染P53和RB。 2）抑制癌基因的表达 使用抑癌基因关闭癌基因表达或使其表达产物失活； 使用反义核酸抑制癌基因的转录,（一）肿瘤基因治疗策略,基因治疗专业知识培训,72,1.抑制和杀伤肿瘤细胞（一）肿瘤基因治疗策略基因治疗专业知识,基因治疗

40、专业知识培训培训课件,2.肿瘤细胞的基因修饰 外源基因的导入可增强肿瘤细胞的免疫原性1）导入细胞因子基因（如IL-2，IL-1等） 导入肿瘤细胞，以刺激机体产生较强的免疫应答，引起抗瘤效应。2）导入MHC基因和共刺激分子基因 肿瘤细胞可通过MHC和共刺激分子表达减弱或缺失逃逸免疫攻击，诱导表达或者直接转染MHC基因和共刺激分子基因 可能提高肿瘤的免疫原性,基因治疗专业知识培训,74,2.肿瘤细胞的基因修饰基因治疗专业知识培训74,1）细胞因子基因导入免疫细胞 Rosenberg教授以细胞因子（如TNF、IL2）基因转导TIL细胞治疗晚期恶性黑色素瘤病人。依据:1）TIL对肿瘤细胞有杀伤作用。2

41、）TIL细胞 在体外杀伤肿瘤细胞效率较LAK强50100倍。,3.调节和增强机体的免疫功能,基因治疗专业知识培训,75,1）细胞因子基因导入免疫细胞 3.调节和增强机体的免疫功能基,2）基因修饰的树突状细胞 用肿瘤抗原基因联合肿瘤抗原肽修饰的树突状细胞效果更好。3）分泌免疫毒素的T淋巴细胞 将免疫毒素基因导入T淋巴细胞，使其表达和分泌免疫毒素，杀伤肿瘤细胞，杀伤作用不受MHC限制。4）肿瘤DNA疫苗 将肿瘤抗原基因克隆到真核表达载体，采用肌肉注射的方法导入体内,3.调节和增强机体的免疫功能,基因治疗专业知识培训,76,2）基因修饰的树突状细胞 3.调节和增强机体的免疫功能基因治,一些严重危害人

42、类健康的病毒性感染，如病毒性肝炎，AIDS病，I型T淋巴细胞病毒感染引起的T淋巴瘤，可采用特异的反义RNA或反义DNA来封闭病毒结构蛋白mRNA，以特异抑制或阻止病毒的表达。 HIV是一种逆转录病毒，和靶细胞膜上CD4分子（受体）结合后进入细胞。逆转录成cDNA，然后整合到宿主染色体。在HIV生命周期中，HIV基因组的复制、转录、表达是可以调节的、利用反义RNA核酸技术用以破坏HIV表达的调控以达到基因治疗的目的。,三、感染性疾病的基因治疗,基因治疗专业知识培训,77,一些严重危害人类健康的病毒性感染，如病毒性肝炎,HIV的基因及其功能,基因治疗专业知识培训,78,HIV的基因及其功能基 因

43、（以前的名称）功,调节基因中以tat （正调节），rev（分化调节），nef（负调节）最重要，三者构成一个调节网络，使病毒能适应各种不同的环境。Tat具有正反馈作用，它可以激活所有的HIV基因；Nef具有负反馈作用，它可以抑制所有的HIV基因的表达；Rev为20KD磷蛋白，它可以抑制调节基因，又可激活毒力基因。每个调节基因通过其基因产物以及其产物发生的反应序列发挥作用。调节基因不仅可以影响病毒结构基因表达，还可以影响其它调节基因表达。,基因治疗专业知识培训,79,调节基因中以tat （正调节），rev（分化调节），n,第 六 节,基因治疗的前景与问题,基因治疗专业知识培训,80,第 六 节基因

44、治疗的前景与问题基因治疗专业知识培训,基因治疗是近20年来分子生物学和重组DNA技术迅速发展的一种结果。从理论上讲，若能将缺陷的基因进行原位的修补，应是疾病的一种根治方法,有着良好的前景，尚有许多理论性和技术性的问题,前 景,基因治疗专业知识培训,81,基因治疗是近20年来分子生物学和重组DN,1.程序繁杂，所用技术专业性强，要求条件高且花费昂贵，在一般医疗机构难以实施，即使有效也很难被临床医生接受。2.必须考虑由病毒载体随机整合所带来的安全性问题。 尽管迄今已批准进行临床试验的病例有106宗，受试者已达600人左右，但都带有很大的盲目性，真正有效的也只有几例。因此想将基因治疗作为疾病的常规疗

45、法为时过早，还有许多理论性的技术性问题有待进一步深入研究，主要着重进行以下几个方面研究。,问 题,基因治疗专业知识培训,82,1.程序繁杂，所用技术专业性强，要求条件高且花费昂贵，在一般,要使基因治疗获得成功，必须具备有用的目的基因。例如, 1989年,囊性纤维瘤基因CFTR的克隆, 1993年就开始了第一例病人的基因治疗临床试验，并取得了较好的效果。要是能发现一个只杀死肿瘤细胞，而不杀死正常细胞的基因，那就可将肿瘤的基因治疗大大地向前推动一大步。,一、发现更多可利用的基因,基因治疗专业知识培训,83,要使基因治疗获得成功，必须具备有用的目的基因。例,要使基因治疗获得成功，还需要研究如何使导入

46、的外源基因在人体细胞中稳定地高效表达。要求外源基因能按需表达，因为外源基因表达过高也会对机体引起病理性损害，这就涉及到基因表达的精细调节问题。 最理想的方法是使导入的外源基因在人体特异组织和细胞中进行长期有效的表达，并能受生理信号的调控。,二、外源基因在人体内的表达调控,基因治疗专业知识培训,84,要使基因治疗获得成功，还需要研究如何使导入的外源基,这个问题的关键是构建转移效率和表达水平均高的载体，并限制其在特定靶细胞表达，就是今后基因治疗基因研究的一个重要方向。,三、基因导入系统的高效性和组织细胞特异性,基因治疗专业知识培训,85,这个问题的关键是构建转移效率和表达水平均高的载体,目前采用最

47、多的是逆转录病毒载体，它进入细胞后整合至宿主细胞染色体的部位是随机的，虽然产生插入突变机率很低，但是这种可能性仍旧是潜在着的。最理想的办法是通过同源重组或者使载体整合在染色体一些非要害部位。,四、导入外源基因对机体的不利影响,腺相关病毒能优先整合至人19号染色体长臂区段,能弄清楚这种定点整合的机制并证明这种定点整合无害处。外源基因表达出大量原来缺乏的蛋白质可能会引起严重免疫反应，甚至导致有害的自身免疫，这一点也是值得引起重视的。,基因治疗专业知识培训,86,目前采用最多的是逆转录病毒载体，它进入细胞后整合,基因治疗不同于以往的任何治疗方法，也不同于以往的基因工程产品的研制，因此其临床应用需要基础研究人员、临床医生及患者三方面密切配合方可实施。尽管基因治疗已在某些方面取得了一些进展，但仍有许多关键性问题尚未解决，其长期有效性和安全性也有待于进一步确定。目前不能对它寄予过高的期望，还应着重进行基础研究，例如发现更多的真正有效的目的基因；构建具有高效转移和高效表达的载体；研究外源基因在体内的表达调控等。这些问题不解决，基因治疗就不可能取得突破性进展。,基因治疗专业知识培训,87,基因治疗不同于以往的任何治疗方法，也不同于以往,