酶的功能及作用ppt课件.pptx

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1、第二章 酶（ Enzyme ）,主要内容,第一节 酶的概况第二节 酶促反应机制第三节 酶促反应动力学第四节 酶活性的调节控制第五节 酶活力测定、酶的制备,第一节 酶的概况,一、酶的概念酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质或核酸分子。,二、酶学研究简史公元前两千多年，我国已有酿酒记载。 一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。 1878年，Kuhne首次提出 Enzyme 一词。 1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。 1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。 1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性

2、，提出核酶（ribozyme）的概念。1995年，发现脱氧核酶。,三、酶的化学本质 1大多数酶是蛋白质 1926年美国Sumner得到脲酶的结晶，并指出酶是蛋白质. 1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。,证据：引起蛋白质变性的理化因素，可引起酶失活两性电解质水解产生氨基酸受蛋白水解酶作用失活具有胶体的性质化学反应,2核酶 1982年美国T. Cech（切克）等人发现四膜虫的rRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现RNA有催化活性。,Thomas Cech University of Colorado at Boul

3、der, USA,Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA,Cech和Altman（阿尔特曼）各自独立地发现了RNA的催化活性，并命名这一类酶为ribozyme（核酶）,3有些DNA也有催化活性 1995年Cuenoud等发现有些DNA分子亦具有催化活性。4抗体酶（abzyme)抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体分子的可变区（即肽链的N端）是识别抗原的活性区域，这部分区域被赋予了酶的属性。 1986年美国Schultz和Lerner两个实验室同时在Science上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。,四、酶促反应的特点

4、,1.酶与一般催化剂的共同点在反应前后没有质和量的变化； 只能催化热力学允许的化学反应； 只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。,酶促反应具有极高的效率酶促反应具有高度的特异性酶促反应的可调节性酶促反应要求严格的环境条件酶易失活,2.酶促反应的特点,五、酶的专一性（特异性）,酶的专一性是指酶对它所催化的反应及其底物具有的严格的选择性，通常一种酶只能催化一种或一类化学反应。,类型,酶的专一性（特异性，specificity）,1、绝对专一性（absolute specificity）,例:,（1）族专一性（基团专一性，group specificity）,相对专一性（relative s

5、pecificity）,（2）键专一性,A B,3、立体专一性（stereospecificity）,（1）D-，L-立体异构专一性,（2）几何异构专一性,（3）酶能区分从有机化学观点来看是属于对称分子中两个等 同的基团，只催化其中的一个基团，而不催化另一个。,例1：,若甘油激酶不能区分两个CH2OH基团，则会生成 :,和,例2：,六、酶的分类,1.根据酶所作用的反应性质,六大类酶催化反应的性质,氧化还原酶类（oxido-reductases）,催化氧化还原反应的酶，包括氧化酶类、脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物酶等。,（1）氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成H2O或H2O2 。,邻苯二酚氧化酶

6、（EC 1.10.3.1，邻苯二酚：氧氧化酶）,邻苯二酚,邻苯醌,（2）脱氢酶类：直接催化底物脱氢,A2H + B A + B2H,例：乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27，L-乳酸：NAD+氧化还原酶）,转移酶类（transferases）,催化基团的转移,例：谷丙转氨酶（GPT）（EC 2.6.1.2，L-丙氨酸： 酮戊二酸氨基转移酶）,水解酶类（hydrolases）,AB + H2O AOH + BH,裂合酶类（lyases）,从底物移去一个基团而形成双键或逆反应,AB A + B,例1：,例2：,异构酶类（isomerase）,催化异构化反应,例：,连接酶类（ligases, 也称sy

7、nthetases合成酶类）,将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATP供能。,例：,（连接酶）,（异构）,（裂合）,（水解）,2.根据酶的分子组成,结合酶各部分作用： 酶蛋白:决定反应特异性 辅助因子：决定反应种类和性质,辅助因子-金属离子,A.稳定酶蛋白构象：稳定酶蛋白催化活性所必需的分子构象B.构成酶的活性中心：作为酶的活性中心的组成成分，参与构成酶的活性中心C.连接作用：作为桥梁，将底物分子与酶蛋白螯合起来D.传递电子、原子或基团E.中和阴离子，降低反应中的静电斥力,辅助因子-小分子有机化合物,主要作用是参与酶的催化作用，在催化中起着原子、电子或某些化学基团的传递。 种类很多，分子结构

8、中常含有维生素或维生素类物质,（共价结合）,3.根据酶的结构,单体酶 通常为一条多肽链，但也有由二硫键相连的多条多肽链的情况。寡聚酶 两个或两个以上亚基组成的酶多酶复合体有几种功能相关的酶靠非共价键彼此嵌合形成的一个复合物称为多酶复合体。多酶体系 在完整细胞内的某一代谢过程中，由几个酶形成的反应体系。多酶体系的存在增加了整个代谢反应的催化效率，同时便于机体对酶的调控。,七、酶的命名,根据国际酶学委员会的建议，每个酶允许有两个名称：习惯名和系统名。1. 习惯命名法：底物名 + “酶” 如淀粉酶有时在名字前加上酶的来源。 如胃蛋白酶反应性质+“酶” 如水解酶 习惯名一般比较简短，使用方便；但缺乏系

9、统性，不够精确，有时会一酶数名或一名数酶的现象。,2. 系统命名法,底物名 + 反应类型 + “酶” 若底物二个或二个以上，则所有底物都需写出，各底物间以冒号隔开。若底物中有水，可省略。所有底物的构型都应标明。反应类型指酶学委员会规定的六种。 例如 “乳酸脱氢酶”的系统名为“L-乳酸 : NAD+氧化还原酶”,酶的标码: 国际酶学委员会规定，每个酶都有唯一的特定标码。如乙醇脱氢酶的编码是：EC1.1.1.1第一个“1” 第1大类，即氧化还原酶类；第二个“1” 第1亚类，供氢体为CHOH；第三个“1” 第1亚亚类，受氢体为NAD+；第四个“1” 在亚亚类中的顺序号又如乳酸脱氢酶的编码是：EC1.

10、1.1.27,第二节 酶促反应机制,活性中心的基团均属必需基团，但必需基团还包括活性中心以外的其他一些基团，它们在维持酶的空间结构、酶活性的调节、免疫等方面起着重要的作用。,一、 酶的活性部位,1. 酶的活性中心,有必需基团组成的，具有一定空间结构的，直接与底物结合，并与酶催化作用直接有关的结构区域（微区）称为酶的活性中心.,2.必需基团,与酶活性有关的基团叫必需基团（essential group ）酶分子中氨基酸侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团,活性中心（active center）外的必需基团必需基团 结合基团：与底物相结合 活性中心内的必需基团 催化基团：催化底物转化成

11、产物,活性中心外的必须基团维持酶活性中心应有的空间构象或作为调节剂的结合部位所必需。,例：胰凝乳蛋白酶的肽链折叠（示活性中心）,结合部位：底物在此与酶分子结合。一个酶的结合部位又可以分为各种亚位点，分别与底物的不同部位结合。催化部位：底物的敏感键在此被打断或形成新的键，从而发生一定的化学反应。一个酶的催化部位可以不止一个。,3.酶的活性中心的特点 都是酶分子表面的一个凹穴，有一定的大小和形状，但它们不是刚性的，在与底物接触时表现一定的柔性。 活性部位为非极性的微环境，这有利于与底物的结合。在活性中心内还含有少数极性基团直接与底物相作用。,溶菌酶,活性中心为一裂缝，可以容纳肽多糖的六个单糖基，并

12、与之形成氢键和范德华力。结合基团是101位的天冬氨酸和108位的色氨酸催化基团是35位的谷氨酸和52位的天冬氨酸。,二、酶促反应机理活化分子：反应中能量较高的、能发生有效碰撞的分子，叫做活化分子活化能：在一定温度下，1摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能。单位kJ/mol,酶的催化机理是降低活化能,例 2H2O22H2O+O2,三、中间产物学说,酶催化时，酶活性中心首先与底物结合生成一种酶-底物复合物（ES），此复合物再分解释放出酶，并生成产物。,一般化学反应历程： S P 酶促反应历程： S + E ES E + P,四、 诱导契合学说（INDUCED-FIT HYPOTHESIS）,195

13、8年Koshland提出“诱导契合学说”： 酶分子活性中心的结构原来并非和底物的结构互相吻合，但酶的活性中心是柔性的而非刚性的。当底物与酶相遇时，可诱导酶活性中心的构象发生相应的变化，其上有关的各个基团达到正确的排列和定向，因而使底物和酶能完全契合，结合成中间络合物，并有利于催化反应的进行。当反应结束后产物从酶上脱落下来后，酶的活性中心又恢复了原来的构象。,五、与酶的高效率催化有关的因素,1邻近效应与定向效应邻近效应：指酶和底物结合形成中间复合物时，底物分子之间，酶的催化基团与底物之间结合与同一分子，使有效浓度增加，从而使反应速率增加的效应（两个反应的分子，它们反应的基团需要互相靠近，才能反应

14、）。 定向效应: 指酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确定向。,2张力效应和底物的形变,3广义的酸碱催化,酸碱催化：瞬时向反应物中提供质子或从反应物中提供质子以稳定过渡态，加速反应。狭义的酸碱催化：在水溶液中通过高反应性的H+离子或OH -离子对化学反应速度表现出的催化作用。广义的酸碱催化：通过H+离子或OH -离子及能提供H+离子或OH -离子的供体进行的催化 组成酶活性中心的极性基团，在底物的变化中起质子的供体或受体的作用。,酶活性中心处可以提供质子或接受质子而起广义酸碱催化作用的功能基团有： 谷氨酸、天冬氨酸侧链上的羧基 丝氨酸、酪氨酸中的羟基 半胱氨酸中的巯基 赖氨酸侧链上的氨基 精

15、氨酸中的胍基 组氨酸中的咪唑基,4共价催化它是指酶活性中心处的极性基团，在催化时，能分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加剧。根据活性中心处极性基团对底物进攻的方式不同，共价催化可分为亲电催化与亲核催化两种。,活性中心处的亲核基团有： 丝氨酸的羟基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基底物上典型的亲电中心：磷酰基、酰基、糖基,特别注意：组氨酸的咪唑基既是很强的亲核基团，又是有效的广义酸碱功能基团。,影响酸碱催化反应速度的因素有两个第一个是酸碱的强度：在这些功能基团中，组氨酸的咪唑基的解离情况pK值为6.0，在生理pH条件下，

16、既可以作质子的供体又可作质子的受体。因此，咪唑基是催化中最有效最活泼的一个催化功能基团；第二个是这些功能基团供出质子或接受质子的速度，其中的咪唑基的情况特别突出，它供出或接受质子的速度十分迅速，其半衰期小于10-10秒。而且，供出或接受质子的速度几乎相等。由于咪唑基有如此的优点，所以虽然组氨酸在大多数蛋白质中含量很少，却很重要，在许多酶的活性中心处都含有组氨酸。推测很可能在生物进化过程中，它不是作为一般的结构蛋白成分，而是被选择作为酶分子中的催化结构而存在下来的。具有酸碱催化特征的酶促反应，酶与底物结合成的中间产物是离子型络合物。,5. 金属离子催化 6. 多元催化和协同效应 7. 活性部位微

17、环境的影响,注意：一种酶的催化反应常常是多种催化机制的综合作用，这是酶促反应高效率的重要原因,第三节 酶促反应动力学KINETICS OF ENZYME-CATALYZED REACTION,酶促反应动力学:研究各种因素对酶促反应速率的影响，并加以定量的阐述。,酶促反应速度的测定,影响因素包括有： 酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。,一、酶浓度对反应速度的影响,当反应系统中底物的浓度足够大时，酶促反应速度与酶浓度成正比，即=kE。,二、温度对反应速度的影响,一般来说，酶促反应速度随温度的增高而加快。但当温度增加达到某一点后，由于酶蛋白的热

18、变性作用，反应速度迅速下降，直到完全失活。 酶促反应速度随温度升高而达到一最大值时的温度就称为酶的最适温度。,三、PH对反应速度的影响,观察pH对酶促反应速度的影响，通常为一“钟形”曲线，即pH过高或过低均可导致酶催化活性的下降。 酶催化活性最高时溶液的pH值就称为酶的最适pH。,最适pH (optimum pH)：酶催化活性最大时的环境pH。,0,酶活性,pH,胃蛋白酶,淀粉酶,胆碱酯酶,2,4,6,8,10,（一）底物对酶促反应的饱和现象：研究前提：单底物、单产物反应 酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示 反应速度取其初速度，即底物的消耗量在5以

19、内的反应速度 底物浓度远远大于酶浓度,四、底物浓度对反应速度的影响,当底物浓度较低时：反应速率与底物浓度呈正比；反应为一级反应,随底物浓度增加：反应速率不再呈正比例增加反应为混合级反应,当底物浓度高达一定程度：反应速率不再增加；反应为零级反应,在其他因素不变的条件下，底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线型,（二）米氏方程式的推导,Michaelis & Menten 于1913年推导出了上述矩形双曲线的数学表达式，即著名的米氏方程(Michaelis equation) 。,V 不同的底物浓度时的反应速率；S 底物浓度；Vmax 最大反应速率；Km 米氏常数,Michaelis-Menten的

20、三个假设： (1)推导的v为反应初速度 产物的生成量很少 k2的反应忽略不计。 (2)反应体系处于稳态 即ES不变 ES的生成量 = ES的分解量(3)S E S ES,ES生成速度：,，ES分解速度：,当酶反应体系处于恒态时：,即：,令：,则：,由于酶促反应速度由ES决定，即,将（2）代入（1）得：,(3),当Et=ES时，,将（4）代入（3），则：,米氏方程的推导,恒态法,（三）KM的意义：,1. Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。即当=Vmax/2时，Km=S。,2. Km值的大小可以近似反应酶与底物亲和力的大小。Km越小，酶与底物的亲和力越大。 3

21、.可用于判断反应级数：当S100Km时，=Vmax，反应为零级反应；当0.01KmS100Km时，为混合级反应。,4. Km是酶的特征性常数：只与酶的性质有关，与酶的浓度无关 。 5. Km可用来判断酶的最适底物：如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该酶的最适底物。,双倒数作图法 LINEWEAVER- BURK ：,（四）Km和Vmax的测定：,（五）双底物双产物反应,A+BP+Q,双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类 :,双底物 双产物的反应,序列反应 （sequential reactions）,乒乓反应 （ping pong reactio

22、ns）,有序序列反应 （orderd reactions）,随机序列反应 （random reactions）,1有序序列反应（ordered reactions 写作 ordered Bi Bi）,2随机序列反应（random reactions， 写作Random Bi Bi）,3乒乓反应（ping pong reactions，写作uni ping pong or Ping Pong Bi Bi）,五、抑制剂对反应速度的影响,凡是能降低酶促反应速度，但不引起酶分子变性失活的物质统称为酶的抑制剂(inhibitor)。 按照抑制剂的抑制作用，可将其分为不可逆抑制作用(irreversibl

23、e inhibition) 和可逆抑制作用(reversible inhibition)两大类。,（一）不可逆抑制作用： 抑制剂与酶分子的某些基团共价结合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不可逆抑制作用。 * 举例 有机磷化合物 羟基酶 解毒 - - - 解磷定(PAM) 重金属离子及砷化合物 巯基酶 解毒 - - - 二巯基丙醇(BAL),有机磷化合物对羟基酶的抑制,路易士气,失活的酶,巯基酶,失活的酶,酸,BAL,巯基酶,BAL与砷剂结合物,（二）可逆性抑制作用： 抑制剂以非共价键与酶分子可逆性结合造成酶活性的抑制，且可采用透析等简单方法去除抑制剂而使酶活

24、性完全恢复的抑制作用就是可逆抑制作用。 可逆抑制作用包括竞争性、反竞争性、和非竞争性抑制几种类型。,1.竞争性抑制（competitive inhibi-tion)： （1）概念： 抑制剂与底物竞争与酶的某一部位结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低，称为竞争性抑制作用。,竞争性抑制,竞争性抑制的速度方程与图形特征,竞争性抑制的双倒数图形特征,（2）竞争性抑制的特点：竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物； 抑制剂同酶的结合部位与底物同酶的结合部位相同或不同； 抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小； 动力学参数：Km值增大，Vm值不变。,* 举例,1.

25、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制,2. 磺胺药对细菌FH2合成酶的抑制,2反竞争性抑制：（1）概念 抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，此抑制作用称酶的反竞争性抑制。,抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合，使ES的量下降。,反竞争性抑制,反竞争性抑制的双倒数图形特征,（2）反竞争性抑制的特点：反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似； 抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合； 必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；抑制程度随底物浓度的增加而增加； 动力学参数：Km减小，Vm降低。,3非竞争性抑制：（1）概念 抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与

26、ES复合物结合，使酶的催化活性降低，称为非竞争性抑制。,抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系。,非竞争性抑制,非竞争性抑制的双倒数图形特征,（2）非竞争性抑制的特点： 非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似； 底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合； 抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响； 动力学参数：Km值不变，Vm值降低。,各种可逆性抑制作用的比较,六、激活剂对反应速度的影响,1.必需激活剂: 对酶促反应是不可缺少的,使酶从无活性变为有活性,必须激活剂常常是金属离子,例如:Mg 2+ 对己糖激酶2.非必需激活剂:在非必需激

27、活剂不存在时,酶仍然有一定的催化活性,但催化效率较低,加入激活剂后酶的催化活性显著升高,许多有机化合物类激活剂都属于此类 ,如胆汁酸对脂肪酶的激活，Cl- 对唾液淀粉酶的激活。,第四节 酶活性的调节控制,The Regulation of Enzyme,酶活性的调节（快速调节）,酶含量的调节（缓慢调节）,调节方式,调节对象 关键酶,酶原激活别构调节共价修饰调节,一、酶原的激活,1.酶原 (zymogen/proenzyme)： 有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。,酶原的激活：在一定条件下，酶原转化为有活性酶的过程。酶原的激活过程不可逆。,2. 酶原激活的机理,

28、3、举例（1） 消化酶的激活A）胰蛋白酶原的激活,胰蛋白酶原的激活过程,B）胰凝乳蛋白酶原（CHYMOTRYPSINOGEN）的激活,C）胃蛋白酶原的激活,胃蛋白酶原的激活过程,酶原激活的本质就是酶的活性部位形成或暴露的过程。,（2）凝血机制被伤害的血管收缩血小板粘聚血液凝集,4.酶原激活的生理意义,避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。,二、变构调节(ALLOSTERIC REGULATION),变构效应剂 (allosteric effector),变

29、构激活剂,变构抑制剂,变构调节,变构酶 (allosteric enzyme),变构部位 (allosteric site),一些代谢物可与某些酶分子活性中心以外的部位可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。,（二）变构酶的性质及作用特点,1.变构酶多为寡聚酶，含多个亚基。2.通常具有四级结构，存在协同效应3.含有催化亚基和调节亚基（或催化部位和调节部位）。4.变构酶的动力学 正协同效应的变构酶其速度-底物浓度曲线呈S形，负协同效应的变构酶其速度-底物浓度曲线为类似双曲线。 由于变构酶动力学不符合米氏酶的动力学，所以当反应速度达到最大速度一半时的底物的浓度，不能

30、用Km表示，而代之以K0.5S表示。,5.变构剂与调节亚基以非共价键特异结合，可以改变调节亚基的构象，进而改变催化亚基的构象，从而改变酶活性。凡使酶活性增强的变构剂称变构激活剂(allosteric activitor)，它能使上述S型曲线左移，饱和量的变构激活剂可将S形曲线转变为矩形双曲线。凡使酶活性减弱的变构剂称变构抑制剂(allosteric inhibitor)，能使S形曲线右移。,变构激活剂使S型曲线左移，变构抑制剂使S形曲线右移。,6.当一个效应物分子与酶结合之后，影响另一相同的效应物分子与酶的另一部位结合称为同促效应； 若一分子效应物和酶结合之后，影响到另一不同的效应物分子与酶的

31、另一部位结合则称为异促效应,变构调节举例,（三）生理意义1.在正协同效应的变构酶的S形曲线中段，底物浓度稍有降低，酶的活性明显下降，多酶体系催化的代谢通路可因此而被关闭；反之，底物浓度稍有升高，则酶活性迅速上升，代谢通路又被打开，因此可以通过细胞内底物浓度的变化来灵敏地控制代谢速度。2.变构抑制剂常是代谢通路的终产物，变构酶常处于代谢通路的入口，通过反馈抑制，可以及早地调节整个代谢通路，减少不必要的底物消耗。,（三） 酶的共价修饰调节,共价修饰(covalent modification)在其他酶的催化下，酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，此过程称为共

32、价修饰。,常见类型磷酸化与脱磷酸化（最常见）乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化SH与SS互变,酶的磷酸化与脱磷酸化,酶蛋白,SerThrTyr,O,P,ATP,ADP,Pi,H2O,蛋白激酶,蛋白磷酸酶,共价修饰调节的特点,受共价修饰的酶存在有（高）活性和无（低）活性两种形式；具有级联效应；是体内经济、有效的快速调节方式。,共价修饰酶通常有活性与非活性两种形式，两种形式之间转换的正、逆反应是由不同的酶催化产生。如骨骼肌中的糖原磷酸化酶有高活性的磷酸化形式与低活性的脱磷酸化形式两种，从脱磷酸化形式转化成磷酸化形式是由磷酸化酶b激酶催化，反之，则是有由磷酸化酶磷酸酶催化。,目前已发现

33、有几百种酶被翻译后都需要进行共价修饰，其中一部分处于分支途径，对其代谢流量起调节作用的关键酶，属于这种酶促共价修饰系统。由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能源，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，所以日益引人注目。,级联效应,第五节 酶的活力测定、酶的制备及 应用,一、酶活力的测定1.概念 指酶催化一定化学反应的能力，通常用最适条件下酶所催化的化学反应的速度来衡量。 酶促反应的速度越快，表示酶的活力越高。反之，则低。,2. 酶活力的表示法 酶活力的大小用酶活力单位来表示。 常用的酶活力单位有三种：（1）. 国际单位： 在标准条件（25、最适p

34、H、最适底物浓度）下，酶在1分钟内转化1umol底物所需的酶量叫做1个酶的活力单位 （IU）。这种单位是由国际酶学委员会规定的。,(2). Kat单位： 在最适条件下，酶在1秒钟内转化1mol底物所需的酶量叫做1个酶的活力单位（1个Kat）。 1 Kat = 60106 IU这是1972年由国际酶学委员会规定的一种新单位。,（3）自定义的活力单位：把酶习惯上或测定时使用的反应速度的单位定义为酶的活力单位。有的甚至直接用测得的物理量，如以单位时间内消光值的变化 (DA/t) 表示酶活力单位。这种方法简单方便，省去了许多计算，但只能进行酶活力的相对比较。,3. 比活力 指每毫克酶蛋白所含的酶活力单

35、位数。即 比活力是酶制剂纯度的一个常用指标。比活力越大，表示酶越纯。,4、酶活力的测定方法,分光光度法、荧光法、同位素法、电化学法等要求：快速、简便、准确 一般包括两个阶段： 首先在一定条件下，酶与底物反应一段时间； 再测定反应液中底物或产物的消耗量或生成量。一般经如下几个步骤： 选择适宜的一定浓度的底物 确定酶促反应的条件 将一定量的酶液和底物溶液混合 反应到一定时间（因要测定酶促反应初速度），取出反应液终止反应 测定产物的生成量。,测定酶活力时应注意几点,（1）应测反应初速度（initial velocity or initial speed）（2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量

36、来表示。 （3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。（4）测定酶反应速度时，应使SE。,二、酶的制备1、工业上大多采用微生物发酵法来获得大量的酶制剂.2、分离纯化酶的方法：盐析法、有机溶剂沉淀法、吸附法。,三 、酶的分离纯化,1选材：酶含量高的材料2破碎细胞：机械破壁，化学破壁 酶破壁 温度破壁等3抽提：缓冲液4去核酸、去多糖5纯化：提取蛋白质方法6保存：低温干燥保存酶的特殊性，在提纯过程中要注意 :1全部操作在低温04。 2在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。3在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量-巯基乙醇。 4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，

37、从而求得比活力，还要计算总活力。,四、酶的应用,1、固定化酶：将一种可溶性酶与不溶性的有机或无机基质结合，或者将其包埋到特殊的具有选择透过膜内来提高酶的稳定性，以便重复和持续利用。 2、固定化酶的性质：（1）酶的稳定性提高；（2）最适PH值改变；（3）酶的活性和催化底物有所变化；（4）最适温度有所提高；3、固定化酶的作用：（1）酶固定化后，不易破损可以反复多次使用；（2）酶不易游离到产品中，产品易于纯化；（3）便于产业化、连续化、自动化。,固定化酶的制备, 吸附法,包埋法,偶联法,五、同工酶,同工酶(isoenzyme)是指催化的化学反应相同，酶蛋白的分子组成形式、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶这类酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。如乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH），具有多种分子组成形式：LDH5（M4）、LDH4（M3H）、LDH3（M2H2）、LDH2（MH3）、LDH1（H4）。,同工酶也是研究代谢调节、分子遗传、生物进化、个体发育、细胞分化和癌变的有力工具，在酶学、生物学、和医学中均占有重要地位。,