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1、5.发酵过程控制与优化,狭义的发酵是指在厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成乳酸或乙醇等的分解代谢过程。广义则将发酵看做是微生物把一些原料养分在合适的发酵条件下经特定的代谢途径转变成所需产物的过程。,5.1发酵过程技术原理,微生物发酵受诸多因素影响，各种因素相互制约，故必须掌握发酵代谢规律，微生物与其周围环境的相互作用和运用分子生物学的原理来操纵代谢物流。微生物发酚过程可分为分批、补料-分批、半连续和连续等几种方式。,分批发酵：是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内。补料-分批发酵：是在分批发酵过程中补入新鲜料液，以克服由于养分的不足，导致发酵过早结束。,半
2、连续发酵：在补料-分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液便可称为半连续发酵。连续发酵： 是指发酵过程中一面补入新鲜的料液，一面以相同的流速放料，维持发酵液原来的体积。,5.2发酵条件的影响及其控制,常规的发酵条件有:罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、油或前体，通氨速率以及补水等。能表征过程性质的状态参数有:pH 、溶氧、溶解二氧化碳、氧化还原电位、尾气中的氧和二氧化碳含量、基质或产物浓度、代谢中间体或前体浓度、菌浓等。培养基对养分的需求：碳源、氮源、矿物盐、特殊养分、复合培养基。,5.3泡沫对发酵的影响及其控制,5.3.1泡沫的产生及其影响发酵过程中因通气搅拌与发酵产
3、生的二氧化碳以及发酵液中糖、蛋白质和代谢物等稳定泡沫的物质的存在，使发酵液含有一定数量的泡沫。泡沫的存在可以增加气液接触表面，有利于氧的传递。但也给发酵带来许多负作用，主要表现在:降低了发酵罐的装料系数。增加了菌群的非均一性。增加了污染杂菌的机会。大量起泡，控制不及时，会引起产物的流失。消泡剂的加入有时会影响发酵或给提炼工序惹来麻烦。,5.3.2发酵过程中泡沫的消长规律发酵过程中泡沫的多寡与通气搅拌的剧烈程度和培养基的成分有关。玉米浆、蛋白陈、花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉、糖蜜等是发泡的主要因素。其起泡能力随品种、产地、加工、贮藏条件而有所不同，还与配比有关。此外，培养基的灭菌方法、灭菌温度和时
4、间也会改变培养基的性质，从而影响培养基的起泡能力。,5.3.3泡沫的控制泡沫的控制方法可分为机械消沫和消泡剂两大类。机械消沫：是指借机械引力引起的剧烈振动或压力变化而起到的消沫作用。消泡剂消沫：发酵工业常用的消泡剂分为天然油脂类、聚醚类、高级醇类和硅树脂类。常用的天然油脂有玉米油、豆油、米糠油、棉籽油、鱼油和猪油等，除作消泡剂外，还可作为碳源。,5.4.发酵终点的判断与自溶的监测,5.4.1发酵终点的判断发酵类型的不同，要求达到的目标也不同，因而对发酵终点的判断标准也应有所不同。判断放罐的指标主要有产物浓度、过滤速度、菌丝形态、氨基氮、pH、DO、发酵液的粘度和外观等。对抗生素发酵，老品种抗生
5、素发酵放罐时间一般都按作业计划进行。但在发酵异常情况下，放罐时间就需当机立断，以免倒罐。新品种发酵更需探索合理的放罐时间。,5 .4 .2自溶的监测发酵后期密切监视菌的自溶情况对稳产和提高下游工段的产物回收率有重要意义。通常把微生物因养分的缺乏或处在不利的生长环境下受其自身的作用开始裂解的过程称为自溶。研究酵母的自溶的基本过程与内部结构的变化证实了蛋白质水解是自溶的基本动力。而细胞壁的降解是次要的。造成自溶的外源因素有:化学物质，如高浓度乙醇、碳氮源或氧的缺乏。,5.5发酵染菌的防治及处理,5.5.1染菌的途径分析染菌的途径不外有以下儿方面:种子包括进罐前菌种室阶段出问题;培养基的配制和灭菌不
6、彻底;设备上特别是空气除菌不彻底和过程控制操作上的疏漏。5.5.2染菌的判断和防治杂菌的发现，常用镜检或无菌试验方法，这是确认染菌的依据。从一些状态参数，如DO变化的规律也可作为染菌预报的根据。遇到早期染菌，原则上可适当改变生长参数，使有利于生产菌而不利于杂菌的生长，如降低发酵温度等。加人某些抑制杂菌的化合物也不失为一种急办法，条件是这种化合物对生产菌无害对生产影响不大和在下游精制阶段能被完全去除。中后期染菌除非是噬菌体，通常后果不会那么严重，这时发酵液中己产生一定浓度的抗生素，对杂菌已有一定抑制作用。实际生产中常采用大接种量的原因之一是即使不慎污染了极少量杂菌，生产菌也能很快占优势。,5.6
7、基因工程菌培养与表达,蛋白在生物医学科学上的应用分4个方面:即疾病或感染的预防;临床疾病的治疗;抗体存在的诊断和新疗法的发现。这方面研究的重点着眼于应用克隆基囚来生产一些称之为生物制品的蛋白，如疫苗、诊断工具和激素等。利用重组DNA技术来生产蛋白有4方面的理由:品种的需求数量上的满足安全具有特异性,胰岛素：在1982年由大肠杆菌生产的胰岛素成为第一个获执照的重组体衍生的人用生物制品。胰岛素是用来治疗I型糖尿病患者。这种病人的胰岛自己不能生成足够的胰岛素，需依赖外源供给。生长激素：儿童的生长和体重的增加要靠其生长激素，这是一种垂体产物。促红细胞生成素：是一种为响应低氧而由肾脏产生的激素，它在骨髓
8、中负责促进红血球细胞的生长和分化。亲甲醇酵母：毕赤酵母是生产外源蛋白的最佳寄主之一，因它具有很强的受甲醇诱导的AOXI启动子。,白细胞介素:是一类具有激活、增殖、成熟和分化机体免疫细胞，抗病毒、抗肿瘤及增强机体免疫功能的细胞因子。 全球氨基酸的年产量估计在5080万吨，其中2/3用于食品，其余大部分作动物词料添加剂用，还有相当数量用于医药工业和作为合成化学试剂的前体。重组DNA技术已成功地应用于提高棒杆菌和其他工业生产菌种的氨基酸生产。 全球的微生物多糖的产值估计已超过10亿美元。这类生物高分子属于胶体，其独特功能在于它们可作为增稠剂、亲水胶体，用于水基系统中的乳化、悬浮和稳定混合物。它们在温
9、度、pH和盐浓度大幅度变化的条件下仍能与其他系统相容，甚至起协同增效作用。,胰岛素的生产,简介,胰岛素(Insulin)是糖尿病， 尤其是I型糖尿病的特效药物，可以促进血液中葡萄糖的利用而降低血糖，并调节糖、脂肪及蛋白质代谢。WHO 相关资料表明：糖尿病已成为继心血管疾病、肿瘤之后的第 3 位主要疾病，严重威胁全人类健康，全球共有糖尿病患者 1.75 亿人，中国糖尿病患者 9200 万人，已超越印度成为亚洲第一大国。2002 年到2012 年的十年间，全球胰岛素的销售额年复合增长率达14.5%；2010年全球胰岛素药物的销售额超过145亿美元，因此胰岛素药物的开发和生产具有重大的社会效益和经济
10、效益。,人胰岛素是利用基因重组技术生产出来的。是利用重组DNA 技术生产与天然胰岛素有相同的结构和功能。可调节糖代谢，促进肝脏、骨骼和脂肪组织对葡萄糖的摄取和利用，促进葡萄糖转变为糖原贮存于肌肉和肝脏内，并抑制糖原异生。,生产企业,丹麦诺和诺德、美国礼来、中国通化东宝、深圳科兴、徐州万邦。美国的礼来和丹麦的诺和诺德是目前向市场供应基因工程胰岛素的主要厂家，他们分别研究和利用大肠杆菌和酵母生产人胰岛素。这两个系统各有利弊，一般讲，大肠杆菌系统表达效率高，但后处理较难 。 酵母系统表达量虽然比较低，但对表达产物的处理较简便。,医用的胰岛素,医用的胰岛素主要有两种，一种是从动物脏器中生化提取的动物胰
11、岛素，如猪胰岛素、牛胰岛素等，动物脏器中生化提取产量低、成本高（100公斤动物胰腺只能提取4-5克胰岛素，一个病人所需胰岛素要从40头牛或50头猪的胰腺中提取）、纯度低，疗效差；一种是通过基因工程手段的人胰岛素，基因重组人胰岛素纯度高、疗效好,生产方法,胰岛素的生产方法主要有两种，一种是从动物脏器中生化提取的动物胰岛素，如猪胰岛素、牛胰岛素等，动物脏器中生化提取产量低、成本高（100公斤动物胰腺只能提取4-5克胰岛素，一个病人所需胰岛素要从40头牛或50头猪的胰腺中提取）、纯度低，疗效差；一种是通过基因工程手段的人胰岛素，基因重组人胰岛素纯度高、疗效好.,通过基因工程手段生产人胰岛素的步骤,1
12、.提取目的基因2.提取质粒 3.基因重组 4.将质粒送回大肠杆菌 5.胰岛素的产生,1.提取目的基因,即从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。1.鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针2.人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子3.从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用。4.PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作。,2.提取质粒,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。此质粒将作为胰岛素基因的载体。 1.碱裂解法：此方
13、法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。 2.煮沸裂解法：指用煮沸加热的方法裂解菌体,以提取质粒。,3.基因重组,取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”,形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。,4.将质粒送回大肠杆菌,在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如 CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的 质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒 吸收. 将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态）。,5.胰岛素的产生,在大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素。 注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。,
