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1、吸收光谱法及荧光分析法,主讲：易有荣,吸收光谱法,吸收光谱法是根据物质对不同波长的光具有选择性吸收而建立起来的一种分析方法。它既可对物质进行定性分析也可定量测定物质含量。包括紫外、可见光及红外吸收光谱等。如果在测定时利用单色器获得的单色光来测定物质对光的吸收能力，则称为分光光度法。 人眼能产生颜色的光区称可见光区，其波长范围为380-760nm。近紫外光区的波长范围为200-380nm。,吸收光谱法,紫外-可见光光分光光度法是根据物质分子对200-760nm光区的吸收特性而进行分析的方法，其特点是： 1)灵敏度高，能测定生物试样中的微量物质。 2）选择性强，由于组分的分子结构不同，它们的吸收光
2、谱不同，因此只要选择适当的分离步骤和实验条件，就可以进行生物试样中的单组分和多组分的测定。 3) 精密度和准确度较高。 4 )仪器设备简单，操作易掌握。定性能力较弱，通常还需与红外、色谱、质谱等技术结合才能作出可靠的定性鉴定。,物质对光的选择性吸收,太阳或白火只灯（钨灯）发出的可见光，是一种由许多不同波长的光所组成的宽广光谱，若将它通过三棱镜分光，则可看到红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色。可见，白光是混合光，它是由多种不同波长范围的单色光按一定比例混合而成的。如果把两种适当颜色的光按一定比例混合也可得到白光，则这两种颜色互称为互补色。物质对光具有选择性吸收的能力。同一物质对不同波长光的吸收能力
3、不同，不同物质对同一波长光的吸收能力也不同。物质所呈现的颜色正是由于它对光的选择性吸收而产生的。,物质对光的选择性吸收,当一束光照射到某一物质的溶液时，若该溶液对可见光谱中各种颜色的光都不吸收则溶液呈透明无色状；若几乎全部吸收则溶液呈黑色；若对各种颜色的光都能均匀吸收一部分则溶液呈灰色。若溶液对其中某些波长的光吸收较多，透过较 少；而对另一些波长的光吸收较少，透过较多，则溶液就呈现这种吸收较少透过较多的光的颜色，即溶液的颜色是它所吸收色光的互补色。 例如；KMNO4的水溶液选择性吸收可见光中的大部分黄绿色光，故呈紫色； 硫酸铜溶液选择性吸收黄光而呈蓝色。,物质颜色与吸收光颜色、波长的关系,物质
4、颜色 吸收光颜色 吸收光波长（nm） 黄绿 紫色 400450 黄色 蓝色 450480 橙色 绿色 480490 红色 蓝绿色 490500 紫红色 绿色 500560 紫色 黄绿 560580 蓝色 黄色 580600 蓝绿色 橙色 600650 蓝绿色 红色 650750,吸收光谱,如果测量某种物质对不同波长光的吸收程度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，则可得到一条曲线，称为吸收曲线，也称可见紫外吸收光谱，它能清楚地描述物质对光的吸收情况。由于有机化合物发色团和助色团的种类、数目及其在分子中所处的位置和环境不同，因此测到的吸收光谱不相同。依据物质吸收光谱的形状和特征可作该物质的鉴别
5、、纯度检查和初步结构分析。,光吸收的基本定律； 朗伯比尔定律,紫外-可见光吸收光谱的最主要用途是定量分析，即通过吸收光谱选择一个或几个测定波长，测定试样中一个或几个组分的含量。紫外-可见光吸收光谱定量分析的基础是朗伯比尔定律。它说明了吸光物质对单色光吸收的程度与该物质的浓度与厚度之间的关系，是吸收光谱的基本定律。 当单色光通过厚度一定、均匀的吸收溶液时，该溶液对光的吸收程度与溶液中物质的浓度C成正比，即A=KBC,光吸收的基本定律； 朗伯比尔定律,K为吸光系数，B为溶液的厚度，C为吸光物质的浓度K与物质的性质、温度、入射光的波长等有关。上式的物理意义为；当一束平行的单色光通过均匀透明溶液时，该
6、溶液对光的吸收程度与溶液中物质的浓度和光通过液层厚度的乘积成正比。,吸收光谱的应用,只要被测物质在紫外可见近红外波段由吸收光谱，就可用光谱分析法来定性和定量分析。 1）定性分析；比较光谱的一致性，与其它方法结合进行分析。 2）定量分析；,标准曲线法,配制与被测组分相同的一系列标准溶液，在与被测组分相同的最大吸收波长下，测定各标准溶液的A值。以A值为纵坐标，以浓度C为横坐标,绘出浓度吸光度关系曲线，就是标准曲线。将样品溶液在相同条件下测定A值，在纵坐标上找出与A值相对应的浓度即为样品的浓度。,标准曲线法,理想的标准曲线应该是；不同浓度的标准溶液所测得的吸光度对浓度作图时，是一条斜率接近于1且通过
7、原点的直线。标准溶液的浓度范围应在被测物质浓度的一半到两倍之间。吸光度在0、051、0之间。绘制标准曲线至少应由五个点，每个点由两个以上的重复值，曲线不能任意延长。,利用标准管计算测定物含量；,将标准与样品分别在相同条件下显色，测定其吸光度，因是相同物质在相同条件下测定，故可按下式计算样品的浓度；A样/A标KC样L/KC标L A样/A标C样 /C标此法适和A-C线性关系良好且通过原点的情况。,紫外分光光度计的基本结构,光源单色器吸收池检测器信号显示系统,紫外分光光度计的基本结构光源,必须具有稳定的、有足够强度的连续光谱，并经聚光镜使之成为平行光。普通白炽灯（钨灯）可用以提供可见光光源，其光谱范
8、围为3202500nm氢弧灯（氢灯）的常用灯为低压氢灯，具有石英窗，能提供紫外光，光谱为180375nm,但实际应用于360nm下。,紫外分光光度计的基本结构单色器,它是分光计的心脏部分，是一种将来自于光源的混合光分解为单色光，并能任意改变波长的装置，包括分光系统、光路狭缝、波长调节器等部件。分光系统有棱镜和光栅两种，使光源色散产生宽广光谱。,紫外分光光度计的基本结构单色器,a、棱镜：有玻璃和石英制成，b、光栅：在石英或玻璃上刻上许多等距离的平行线（一般每毫米上千条），通过光的“干涉”而分成光谱。c、狭缝：分入光狭缝和出光狭缝。一般两者宽度一致。狭缝愈窄，光束波愈纯。狭缝宽度常以毫米表示。d、
9、波长调节器：一般是调节准直镜位置以选择分光光谱的波长。,紫外分光光度计的基本结构吸收池,比色杯有不同规格和形状，玻璃比色杯用于可见光光度测定，石英比色杯用于紫外分光光度测定也可用于可见光。吸收池仅有两面透光具有光学性质;另两面以磨沙玻璃为材料以示区别，比色杯的光学表面不能有任何污染。每次使用完毕，立即到空然后用水清洗34次最后可用甲醇冲洗;用蘸有洗涤剂的海绵清洗效果较好。如果以上步骤无效时，可将比色杯在50硝酸中短时浸泡，再用水充分冲洗。,紫外分光光度计的基本结构检测器,其主要作用是接受透射光信号变成电能，必要时加以放大。有三种类型；光电池、光电管、光电倍增管,紫外分光光度计的基本结构,信号显
10、示系统：,Lambda25型紫外主要功能及应用范围,Lambda25型紫分光光度计 主要功能及应用范围,能定性定量测定所有再190n-1100nm波长范围内有吸收的化合物。1） 波长扫描功能：用于定性分析。2）波长编程功能：可同时测量2-8个波长点的OD值。3） 时间扫描功能：用于动力学研究。4)浓度测定功能：用于定量分析。,紫外吸收法测定核酸含量,原理：核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都含有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键（C=C-C=C-），能强烈吸收250290nm的紫外光，其最大吸收在260nm左右。,紫外吸收法测定核酸含量,在定性鉴定各类核苷酸物质时，先测定它们在几个特定波长的紫
11、外吸收值，然后根据A250/A260、A280/A260、A290/A260比值，来判定是哪一种核苷酸。在定量测定时，可根据在特定波长（一般在260nm）的紫外吸收值计算含量。,紫外吸收法测定核酸含量,另外旦白质液具有紫外吸收，其吸收高峰在280nm处，在260nm处吸收值仅为核酸的1/10或更低。因此对于含有微量蛋白质的核酸样品测定误差小，根据核酸在260nm和280nm吸收比值可判定核酸的纯度，,紫外吸收法测定核酸含量,RNA的纯度A260/A280应该为2以上，若小于2表示可能有蛋白质污染DNA的纯度A260/A280应该为1.8,若小于1.8表示可能有蛋白质或酚污染；大于1.8表示可能
12、有RNA污染。,紫外吸收法测定蛋白质的含量,原理：由于蛋白质中骆氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有紫外吸收特性，吸收峰在280nm处，在此波长时，蛋白质溶液的吸光度A280与其含量成正比关系，可用作定量测定。,紫外吸收法测定蛋白质的含量,由于核酸在280nm也有吸收，对蛋白质测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm若同时测定260nm的光吸收，则通过计算可消除核酸对蛋白质的影响。,紫外吸收法测定蛋白质的含量,其缺点是当待测蛋白质与标准蛋白质中的骆氨酸和色氨酸残基含量差异较大时会产生一定的误差，不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，即使经过校正，测定结果还存在一定误差。因此
13、紫外吸收法仅作为初步定量依据。蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260蛋白质浓度（mg/ml0=1.55A280-0.76A260,GENios多功能酶标仪主要功能,集多种检测于一体 光吸收（Absorbance）-紫外及可见光（2301000nm） 紫外可见荧光测定（230700nm） 生物连续发光测定、化学连续发光测定兼容多种样品模式 61536微孔板、PCR管、比色杯顶部与底部阅读，贴壁细胞和带盖样品选用底部读数 结果更准确多达32块滤光片的光路设计广泛地用途 DNA、RNA、旦白质光吸收和荧光定量 ELISA及荧光ELISA实验、报告基因实验（Luciferase）
14、、细胞学相关研究等,Magellan包含6种主要向导类型,酶标仪的操作软件Magellan包含6种主要向导类型；并由向导引导操作者自动完成仪器操作。其向导类型由：获得原始数据：通过设置参数和启动测量快捷得到原始数据。运行一个方法；根据已定义的方法操作仪器。结果求值：可查看原始数据并获得原始数据和运行一个方法获得结果求值。创建/编辑一个方法；定义和编辑一个方法该方法包含必要的测量参数、结果求 值、数据处理。创建/编辑样本ID列表：杂项：,荧光分析法,荧光分析法,基本原理 某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluoresce
15、nce analysis）。 荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低24个数量级。,荧光分析法,荧光分析法的应用范围荧光分析在医学检验、生物医学、药物血浓、环境监测、食品分析应用较多。主要用于胺类如组织胺、多巴胺，甾族化合物、DNA、RNA、酶、辅酶、青霉素、连霉素维生素、强心甙、麻醉剂。,荧光分析法,荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitati
16、on spectrum）。,荧光分析法,实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。,荧光分析法,对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于
17、或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。当高浓度时，由于自粹灭和自吸收使荧光强度和浓度不呈线性关系，发生负偏差。因此分析时注意在校正曲线的线性范围内进行。,荧光分析法,荧光仪的主要部件 测定荧光可用荧光计和荧光分光光度计，二者的结构复杂程度不同，但其基本结构是相似的。由光源发出的光，经单色器让特征波长的激发光通过，照射到液槽使荧光物质发射出荧光，经第二个单色器让待测物质所产生的特征波长荧光通过，照射到检测器产生光电流，经放大后以指针指示或用记录仪记录其信号。,荧光分析法,仪器的主要部件如下：光源：发射紫外区和可见区的激发光，一般常用的为溴钨灯和汞蒸汽灯，以及氙弧灯。单色器：仪器共有两个单色
18、器，作用分别是滤去非特征波长的激发光，和滤去非特征波长荧光的杂散光。液槽：用来盛放待测溶液。检测器：检测待测物质所发射的荧光信号。,荧光分析法,荧光分析法的定性和定量（一）定性分析 荧光物质特性的光谱包括激发光谱和荧光光谱两种。在分光光度法中，被测物质只有一种特征的吸收光谱，而荧光分析法能测出两种特征光谱，因此，鉴定物质的可靠性较强。当然，必须在标准品对照下进行定性。,荧光分析法,（二）定量测定 荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。直接测定法： 利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定，最简单的便是直接测定法。某些物质只要本身能发荧光，只须将含这类物质的样品作适当的前
19、处理或分离除去干扰物质，即可通过测量它的荧光强度来测定其浓度。具体方法有两种。,荧光分析法,直接比较法： 配制标准溶液的荧光强度Fx，已知标准溶液的浓度Cs，便可求得样品中待测荧光物质的含量。 如果空白溶液的荧光强度调不到零，则必须从Fs和Fx值中扣除空白溶液的荧光强度F0，然后进行计算。,荧光分析法,标准曲线法： 将已知含量的标准品经过和样品同样处理后，配成一系列标准溶液，测定其荧光强度，以荧光强度对荧光物质含量绘制标准曲线。再测定样品溶液的荧光强度，由标准曲线便可求出样品中待测荧光物质的含量。,荧光分析法,间接测定法：有许多物质，它们本身不能发荧光，或者荧光量子产率很低，仅能显现非常微弱的
20、荧光，无法直接测定，这时可采用间接测定方法。,荧光分析法,间接测定方法有以下几种：（1）化学转化法：通过化学反应将非荧光物质变为适合于测定的荧光物质。例如金属与螯合剂反应生成具有荧光的螯合物。有机化合物可通过光化学反应、降解、氧化还原、偶联、缩合或酶促反应，使它们转化为荧光物质。（2）荧光猝灭法：这种方法是利用本身不发荧光的被分析物质能使某种荧光化合物的荧光猝灭的性质，通过测量荧光化合物荧光强度的下降，间接地测定该物质的浓度。,荧光分析法,减小测量误差的方法（1）溶剂：溶剂能影响荧光效率，改变荧光强度，因此，在测定时必须用同一溶剂。（2）浓度：在较浓的溶液中，荧光强度并不随溶液浓度呈正比增长。
21、因此，必须找出与荧光强度呈线性的浓度范围。（3）酸度：荧光光谱和荧光效率常与溶液的酸度有关，因此，须通过条件试验，确定最适宜的pH值范围。,荧光分析法,（4）温度：荧光强度一般随温度降低而提高，因此，有些荧光仪的液槽配有低温装置，使荧光强度增大，以提高测定的灵敏度。在高级的荧光仪中，液槽四周有冷凝水并附有恒温装置，以便使溶液的温度在测定过程中尽可能保持恒定。（5）时间：有些荧光化合物需要一定时间才能形成；有些荧光物质在激发光较长时间照射下会发生光分解。因此，过早或过晚测定荧光强度均会带来误差。必须通过条件试验确定最适宜的测定时间，使荧光强度达到量大且稳定。为了避免光分解所引起的误差，应在荧光测定的短时间内才打开光闸其余时间均应关闭。,完,
