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1、RNA测序技术原理及应用,遗传的中心法则,基因组转录组表观遗传组蛋白组层次,什么是转录组？,RNA是解读基因组的关键,RNA,Protein,Phenotype,Genotype,DNA,RNA 测序技术,Workflow of RNA-Seq,样品检测文库制备Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析,Total RNA样品检测,Agilent 2200 检测OD260/280:1.82.2 RNA 28S:18S 1.0; RIN7,新型安捷伦2200 TapeStation系统是新一代测序（NGS）、生物微阵列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白质纯化
2、和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制（QC）的理想解决方案。可扩展的通量16联或96孔微量滴定板快速得到结果平均每个样品只需一分钟便可获得结果使用简单可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程样品用量少每次运行仅需要不到2ul样品,检测报告-合格样品,棉铃虫/果蝇,检测报告-不合格样品,Workflow of RNA-Seq,样品检测文库制备Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析,真核mRNA的纯化,mRNA的纯化主要通过的磁珠与生物素吸附原理从而分离纯化Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要是mRNA的3的poly A与磁珠在bindi
3、ngbuffer的作用下相结合。磁珠通过MPC（磁分离器）从溶液中分离出来。mRNA与磁珠结合后，再用Tris-HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中。,链霉亲合素包被磁珠+生物素标记Oligo（dT）25+poly（A）,原核mRNA的纯化,Ambion MICROExpress Kit,LNA扣锁型探针,mRNA反转录-fragment+RT,纯化过的mRNA样品加入1 l的fragment buffer 70作用1.5min。加入1l的stop buffer终止反应。加入沉淀剂（NaAc 糖原 无水乙醇）沉淀产物。RTds cDNA,末端修复(防止自连）cDNA 3末端加AAdapter连接
4、,第一天,消化DNA,mRNA的分离,mRNA的打断,cDNA的合成,第二天,末端修复,加接头,胶回收,3端加A,第三天,PCR,PCR胶回收,文库制备,文库质量检测：Aligent 2100：片段大小、纯度、浓度qPCR：片段大小、浓度手工检测：跑胶验证。,Workflow of RNA-Seq,样品检测文库制备Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析,HiSeq 2500,Applications of RNA-Seq,17,RNA-Seq (Transcriptome),Workflow of RNA-Seq(Transcriptome),生物信息
5、学分析,RNA-Seq (Transcriptome),Characterize the transcriptome in unparalleled detail,Technique 2,20,RNA-Seq (De novo transcriptome assembly),RNA-Seq (Transcriptome resequencing),RNA-Seq (De novo transcriptome assembly),文库构建,测序,组装,De novo assemble a transcriptome组装流程,数据产出统计及测序数据的成分和质量评估组装结果分析（Contig 长度分
6、布、Scaffold 长度分布、Unigene 长度分布）Unigene （transcript）功能注释Unigene 的GO 分类Unigene 代谢通路分析预测编码蛋白框（CDS）Unigene 表达差异分析（两个或两个以上样品）Unigene 在样品间的差异GO 分类（需两个或两个以上样品）和Pathway 富集性分析,De novo assembly transcriptome 信息分析主要内容：,De novo assembly transcriptome信息分析流程,Unigenes的GO 注释,Pathway 分析,RNA-Seq (Transcriptome resequen
7、cing),cDNA文库构建,测序,比对到参考序列,Transcriptome resequencing比对流程,比对统计基因表达注释基因差异表达分析基因结构优化可变剪接分析预测新转录本cSNP分析,Transcriptome resequencing信息分析主要内容,Transcriptome resequencing信息分析流程,应用-优化转录组注释信息,基因结构优化可变剪接鉴定基因融合鉴定RNA水平SNP分析,Genomic intergenic region,Readscluster,Paired Readsdistribution,优化基因结构鉴定新的转录本,Paired-End (
8、PE) Reads,Reads 比对到参考序列基因间区域,鉴定可变剪接（ Alternative Splicing ）,exon1,exon2,exon3,exon1,exon2,exon3,exon1,exon3,common reads,junction reads,mRNA,鉴定基因融合,分析RNA水平SNP,转录组重测序比对软件：SOAPDe novo 转录组测序: 组装软件：SoapDenovo比对软件： SoapSNP,36,转录组研究技术横向比较,转录组测序的优势,RNA测序与芯片检测基因数比较,RNA测序与芯片检测基因的表达量分布,Genome Res 2010,Case,实验
9、材料收集： 叶片，花序, 果实, 根 时间点：0 , 4, 8, 12, 16, 20和 24 h 将每个时间点采集的样品均匀混合 测序策略： Illumina 测序，1G data,1. High light 2.Heat 3. Cold 4. Salt 5.Drought,抗逆相关可变剪接,外包膜蛋白16 (AT2G28900),Intron-retention,Control,Low Temperature Resistance,低温胁迫相关的AS,低温胁迫下这个内含子和对照相比被保留了下来，揭示了可变剪接有重要功能。,AS调节机制,CCA1,生物钟相关基因，例如调节气孔的开关等,RNA
10、-Seq单端测序（Quantification）等同于数字表达谱(DGE),Workflow of RNA-Seq单端测序（Quantification）,生物信息学分析,RNA-Seq单端测序（Quantification）生物信息分析内容,测序数据评估筛选差异表达基因表达模式聚类分析GO 功能富集分析Pathway 富集分析蛋白互作网络分析,RNA-Seq单端测序（Quantification）信息分析流程,RNA-Seq与基因芯片优缺点比较,case,Plant Physiology 2010,取样： 选取在成熟季节开花后 5, 10, 和15个星期葡萄分别代表葡萄果实成熟中的三个时期（
11、post setting, veraison和ripening）数据量： 超过59M reads数据， 长度在36-44bp之间,运用RNA-Seq技术对葡萄果实发育过程中复杂转录特征的研究。,表二 reads在基因组上的分布情况,表一 测序数据,葡萄RNA-Seq单端测序,浆果发育三个阶段共有、特有基因表达分布图,基因表达量分布,表达簇的分类分布情况,差异表达的基因GO功能注释-分成了19个功能类群-按照基因在三个不同时期的表达趋势进行分类，分成8个cluster。将基因的表达和它调控的一个生理功能联系在了一起。,RNA-Seq对浆果标记基因的验证,用RNA-Seq的数据去验证已报到的十个浆果成熟期的mark基因。事实上从其它方法得到的数据去验证了RNA-Seq数据的准确性。,RNA-Seq结果与RT-PCR具有高度一致性,RT-PCR验证结果,Thats all, thank you!,
