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1、第十五章 酵母菌基因工程,酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物。共有56属和500多个种组成。酵母是最成熟的真核生物表达系统。,第一节 简介,发展历程,1974，Rlarck-walker和Miklos发现在大多数酵母中存在质粒。1978，Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。,1981，Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。1983，我国首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。1996，完成了第一个真核生物酿酒酵母全基因组的测序。,酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统,优势在于
2、：,安全无毒，不致病；有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；,易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；,培养条件简单，容易进行高密度发酵；能将外源基因表达产物分泌到培养基中；有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。,缺陷在于：,表达效率相对低；酵母常有密码子偏爱性，真核基因在其中表达时需要人工修正。,酵母基因工程的发展现状,目前酵母基因工程中发展和应用较多有酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母等，其应用主要体现在以下两方面：,酿酒酵母的自身改造：,将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母（可自身分泌葡萄糖淀粉酶）。将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母（可自身分泌蛋白水
3、解酶）,将-葡聚糖酶基因导入酿酒酵母（可有效降解麦芽汁中的-葡聚糖，改善啤酒的过滤效率）,将ATP硫酸化酶和腺苷酸硫酸激酶在酿酒酵母体内表达（促进SO2的生成，维持啤酒风味的稳定）,将人血清清蛋白（HAS）基因转化到酿酒酵母（生产出富含HAS的啤酒新品种）,酵母表达异源蛋白,表达水平:酵母表达系统主要用于表达外源基因，表达水平的高低直接关系到其应用价值。酵母的高效表达从三方面实现：,通过开发高效的启动子提高和控制外源基因的转录水平。提高表达载体在细胞中的稳定性。通过多次同源重组以及rDNA介导的整合两种方式提高表达基因在细胞中的拷贝数。,表达质量：除表达水平外，外源基因表达质量的好坏也直接关系
4、到酵母表达系统的应用价值。,酵母基因工程的发展趋势,解决酵母基因工程中还存在的缺陷；在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向；,利用酵母基因工程筛选更多的制药；改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本；酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注。,广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌,第二节、酵母菌的宿主系统,广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：,其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基
5、因最理想,属名 举例酵母属 酿酒酵母克鲁维酵母属 乳酸克鲁维酵母毕赤酵母属 巴斯德毕赤酵母裂殖酵母属 非洲酒裂殖酵母汉逊酵母属 多态汉逊酵母,提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌,使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变,利用经典诱变技术筛选分离酿酒酵母的核突变株或细胞质突变株，可以提高重组异源蛋白在酵母菌中的合成产率。然而，有些在表型上能提高某种特定异源蛋白表达的突变株未必具有促进其它外源基因表达的能力，因为提高一种特定异源蛋白合成和分泌的影响因素极其复杂，其中包括表达产物本身的生物化学和生物物理特性，只有那些能促进任何外源基因分泌表达的基因型稳定突变株，才能用作理想的基因工程受体细胞。,许
6、多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。,抑制超糖基化作用的突变宿主菌,酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修饰和加工系统对来自高等动物和人的异源蛋白活性表达是极为有利的，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。,突变类型 生物效应 mnn 甘露糖生物合成缺陷型 alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 och 外侧糖链添加缺陷型,这些突变菌株不能在异源蛋白的天门冬酰胺侧链上延长甘露多聚糖长链，这是酿酒酵母超糖基化的一种主要形式。,含有mn
7、n9突变的酵母菌细胞缺少能聚合外侧糖链的a-1,6-甘露糖基转移酶活性，而och1突变株则不能产生膜结合型的甘露糖基转移酶。尽管其它类型的突变株尚未进行有效的鉴定，但它们却能使异源蛋白在天门冬酰胺侧链上进行有限度的糖基化作用，基本上杜绝了糖基外链无节制延长的超糖基化副反应。,减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,泛素介导的蛋白质降解作用,第一类基因含有多个泛蛋白因子编码重复序列，各重复序列头尾相连形成多拷贝结构；,酵母菌的泛蛋白因子编码基因分为两大类：,第二类基因为单一泛蛋白因子编码序列与另一个不相关的多肽编码序列的融合基因，后者称为羧基延伸蛋白（CEP），它也有两种大小不同的序列，其
8、中CEP52由52个氨基酸残基组成，而CEP76-80则由76-80个氨基酸残基组成。,在酵母菌中共有四个基因编码泛蛋白因子：,UBI1和UBI2编码融合蛋白泛蛋白-CEP52UBI3编码泛蛋白-CEP76UBI4则编码一个五聚体泛蛋白因子,UBI1、UBI2和UBI3基因均能在酵母菌对数生长期内表达，当菌体进入稳定期后便自动关闭，UBI4的表达时序与前三种基因恰好相反，这说明四种基因编码产物的生物学功能并不完全相同。,第一类基因包括UBC4、UBC5和UBC7，其编码产物只拥有相应的保守结构域，多肽序列的其它区域并没有明显的同源性，这些蛋白形成泛蛋白-靶蛋白共价接合物的活性严格依赖于E3蛋白
9、的存在；,几个编码泛蛋白因子接合酶系统的酵母菌基因（UBC）,第二类基因包括UBC1、UBC2、UBC3和UBC6，它们的表达产物具有天然的C端延伸活性，不需要E2蛋白的参与便可进行泛蛋白的接合反应。,如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种降解作用减少到最低程度：,第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，迅速被转位到分泌器中，即可有效避免降解作用；,第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表达，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白因子的束缚，从而减少由
10、降解效应带来的损失；,第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变株作为外源基因表达的受体细胞。,UBI4缺陷型：在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。,减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌：,泛素降解途径衰减的酿酒酵母,UBA1缺陷型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。,Ubc4-ubc5双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。,内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌
11、,酿酒酵母拥有二十多种蛋白酶，尽管不是所有的蛋白酶都能降解外源基因表达产物，但实验结果表明有些蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表达。,将大肠杆菌的lacZ作为报告基因分别导入两株具有相同遗传背景的酿酒酵母菌中，其中一株含有编码空泡蛋白酶基因PEP4的野生型菌株，另一株则为pep4-3突变株，比较这两株菌中b-半乳糖苷酶的活性，在同等试验条件下pep4-3突变株中的b-半乳糖苷酶活性明显高于PEP4+的野生菌，而且在间歇式发酵罐中，pep4-3突变株也能长到相当高的密度。,PEP4蛋白酶除了具有降解蛋白质的功能外，还能对某些重组异源蛋白进行加工。例如，MFa1-人神经生长因子（hNGF）原前体
12、的融合蛋白只能在pep4突变株细胞中进行正确的加工剪切，这说明PEP4蛋白酶或者细胞内其它一些被PEP4蛋白酶激活和修饰的蛋白酶系统与重组异源蛋白的正确加工剪切过程有关。,第三节、酵母菌的载体系统,载体的一般结构：,选择标记复制子表达盒启动子先导序列终止子有用的蛋白结构域,酵母菌种的野生型质粒,酿酒酵母中的2环状质粒,几乎所有的酿酒酵母都含有2双链环状质粒，拷贝数维持50-100个。,Irs反向重复序列600bp，重组FLP编码产物驱动Irs的同源重组，REP编码产物控制质粒的稳定性，STB是REP的结合位点。,接合酵母属中的pSRI、pSR1、pSB2和pSR1以及克鲁维酵母属中的pKD1质
13、粒等，均有类似的结构。,乳酸克鲁维酵母中的线性质粒,乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线性质粒pGKL1和pGKL2，拷贝数为50-100个，分别携带K1和K2两种能致死宿主细胞的毒素蛋白基因。,酵母菌克隆表达质粒的构建,能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数，可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增；,酵母克隆表达质粒的特点：,含有在酵母中便于选择的遗传标记，这些标记一般能和酵母相应的突变体互补，如Leu+、His+、Ura+、Trp+等，有些还携带用于大肠杆菌的抗生素抗性标记；,含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。,ARS为酵母菌中的自主复制序列，大小在0.8-1.5Kb
14、,染色体上每30-40bp就有一个ARS元件。,含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建,由染色体ARS构成的质粒称为YRp，而由2质粒构建的杂合质粒为YEp。上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但是经过几代培养后，质粒丢失率达50%-70%，主要由于分配不均匀所致。,CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列。将CEN插入到ARS质粒中，获得的新载体称为YCp。YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数通常只有1-5个。,含有CEN的YCp质粒的构建,利用酵母菌的端粒TEL.CEN.ARS等DNA元件构建人工酵母染色体，可以克隆扩增大片段的外源DNA，这是构建YAC
15、载体的基本思路YAC载体的装载量可高达800kb，适用于构建人的基因组文库。,含有TEL的YAC质粒的构建,整合型质粒载体YIP及其构建,YIP 载体由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA 片段组成，可与受体或宿主的染色体 DNA 同源重组，整合进入宿主染色体中，酵母片段只提供选择性标志，没有复制起点。转化率低（只有1-10转化子/微克DNA），但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析。,复制型质粒载体YRP及其构建,同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，又称穿梭载体；带有选择标记和复制子的酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。优缺点：转化率高，拷贝也高，但不稳定，易丢失。,附加体型质粒载体YEP及其
16、构建,由大肠杆菌质粒、2u质粒以及酵母染色体的选择标记构成。2u质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区，STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。对酵母基因很高的转化活性，比YRP型载体更稳定，拷贝数也高，是基因克隆中的常用载体。,YEp13质粒,载体PYF92：酵母的2质粒pBR322质粒酵母的His+基因,酵母人工染色体载体（ YAC ）,YAC 载体是由酵母染色体中分离出来的 DNA 复制起始序列、着丝点、端粒以及酵母选择性标记组成的能自我复制的线性克隆载体。 YAC 载体是以质粒的形式出现，长度约 11.4kb ，带有人工染色体所需的一切元件。每个 YAC 载体可以装进 100 万
17、碱基以上的大片段 DNA ，比柯斯质粒的装载能力要大得多。,复制元件：YAC 载体的复制元件是其核心组成成分,自主复制序列用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒两个端粒,标记基因：主要采用营养缺陷型基因，Trp+、Leu+、His+、Ura+等,第四节、酵母菌的转化系统,酵母菌的转化程序转化质粒在酵母细胞中的命运用于转化子筛选的标记基因,酵母菌的转化程序,酵母菌原生质体转化法,早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球转化法。在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达存活的原生质球总数的1%-5%。但是操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。,酿酒酵母的碱金属细胞经碱金属离子（如
18、Li+等）、PEG热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA。,碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化,酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较大的负作用。其优势在于不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率高达105转化子/gDNA。,酵母菌电击转化,转化质粒在酵母细胞中的命运,单双链DNA均可高效转化酵母菌，但单链DNA的转化率是双链的1030倍。含有酵母复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制。,不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体，这对于体内定点突变酵母基因组极为有利。,同源重组
19、的频率取决于整合型质粒与受体菌基因组之间的同源程度以及同源区域长度，一般来说，整合子占转化子总数的5080%。,用于转化子筛选的标记基因,用于酵母菌转化子筛选的标记基因：,营养缺陷型互补基因显性基因,营养缺陷型的互补基因,营养缺陷型互补基因主要由氨基酸和核苷酸生物合成基因如：Leu 、Trp、 His、 Lys、 Ura 、Ade。但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。,显性标记基因,显性标记基因的编码产物,标记基因 编码产物 遗传表型 Aph 氨基糖苷转移酶 抗G418 Cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素 Dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 Cup1 铜离子螯合物 耐受
20、铜离子 Suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖 Ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂,第五节、酵母菌的表达系统,酵母菌启动子的基本特征和选择,用于启动转录蛋白质结构基因的酵母菌型启动子的特征：,基本区调控区,TATA盒转录起始位点。,上游激活系列（UAS）上游阻遏序列（URS）,利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中克隆和筛选具有特殊活性的强启动子；从已有的启动子中构建杂合启动子。,利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中克隆和筛选具有特殊活性的强启动子，所使用的无启动子报告基因为疱疹单纯病毒的胸腺嘧啶激酶基因（HSV1-TK）。,Thd + ATP TMP + ADP,TK,利用氨甲喋呤和对氨基
21、苯磺酰胺抑制其dTMP的生物合成。,将HSV1-TK基因与pJDB207重组构建一个启动子探针质粒，在TK基因上游的单一限制性酶切口处插入随机断裂的酵母菌基因组DNA片段，从含有氨甲喋呤、对氨基苯磺酰胺以胸腺嘧啶的选择培养基上即可获得含有启动子活性片段的阳性转化子。,将酿酒酵母的乙醇脱氢酶基因（ADH2）所属启动子的上游调控区与甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）所属启动子的下游基本区重组在一起，构建出ADH2-GADPH型杂合启动子。ADH2启动子为葡萄糖阻遏并可用乙醇诱导，而GADPH启动子是酿酒酵母细胞中最强的组成型表达启动子。,杂合启动子,另一个相似的杂合启动子由丙糖磷酸异构酶（T
22、PI）基因的强启动子和一个温度依赖型阻遏系统（sir3-8ts-MATa2）的操作子序列构成，这种杂合启动子的一个显著特征是可用温度诱导表达外源基因。,酵母菌启动子的可调控表达系统,温度控制性启动子,酵母交配型转变酵母有两种交配类型 a 和，单倍体孢子 a 和之间交配才产生 a/ 二倍体，经减数分裂及产孢过程形成4 个单倍体孢子；相同交配型的单倍体孢子之间不能发生交配。,酿酒酵母的a和两种单倍体，分别由MATa和MAT两种等位基因决定。MAT由顺反子MAT1和MAT2组成，前者决定1的激活过程，后者决定2阻遏过程。MATa中，a1和a2蛋白共同决定a1- a2阻遏,交配型转换的遗传基础：,控制
23、交配型的MAT基因位于第3染色体上，MATa：a交配型，MAT：交配型；两基因互为等位基因；在MAT基因两端有同源序列HML和HMRa，由于两基因上游存在沉默子，故不表达，但可分别与MAT、MATa基因序列相同。,遗传学家们发现了4个不连锁的基因沉默交配型调节基因，SIR（silent information regulator）1、2、3和4，这些基因产物共同起反式作用（它们并不在同一条的染色体上）来阻止沉默交配型基因的表达。若这4个SIR基因中任何一个基因失去作用的话，那么HML和HMRa基因就会以MAT座位上的基因相同的速率进行转录。,利用上述细胞类型决定簇的两种特异性突变基因可以构建对
24、克隆的外源基因表达进行温度控制的二元系统 ：,温度敏感型突变体sir3-8ts。2蛋白的突变体hml2-102-导致它在与a1蛋白交配时对MAT顺反子阻遏活性的丧失，但仍保留a-特异性基因的能力。,因此具有MATa-hml2-102-HMRa-sir3-8ts基因型的酵母细胞在25培养时，应具有a交配类型，因为此时只有MATa基因能表达，hml2-102和HMRa均为Sir蛋白所阻遏。,当细胞生长在35时，MAT、HML和HMR基因均能表达，只有2基因被阻遏，因此细胞呈现交配型。,当外源基因置于a-特异性基因的启动子控制之下时，a交配型的受体细胞在25时可以表达该基因，但在35时不表达。,上述
25、系统为外源基因的表达提供了一种二元调控模式：,a型启动子,如果外源基因与-特异性基因的启动子重组，则仅在35时表达，而在25不表达。,型启动子,超诱导型启动子,当酿酒酵母生长在无半乳糖存在的培养基时，其GAL1、 GAL7、 GAL10启动子受到阻遏；加入半乳糖时，启动子活性被诱导1000倍。,严紧控制表达系统：启动子受某种因素的调节，使其表达控制在一定的水平。,一种以人雄激素受体为中心的严紧控制表达系统能有效地将外源基因的表达水平控制在一个合适的范围。此系统中，雄激素受体表达水平、雄激素浓度以及重组质粒拷贝数三者之间的平衡，可以有效作用于对雄激素具有应答能力的启动子。,外源基因在酵母菌种表达
26、的限制性因素,外源基因稳态mRNA的浓度外源基因mRNA的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性-在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质中96%以上的氨基酸是由25个密码子编码的外源基因稳定态mRNA的半衰期,酵母菌表达系统的选择,酿酒酵母表达系统 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。,酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。,乳酸克鲁维酵母表达系统,乳酸克鲁维酵母的双链
27、环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传40代以上。乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌性的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。,巴斯德毕赤酵母表达系统,巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速；乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子；表达的可诱导性。,三大优势：,由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。,多型汉逊酵母表达系统,多型汉逊
28、酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体，与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多个拷贝。,重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中成功表达。,第五节、酵母菌的蛋白修饰分泌系统,蛋白质的分泌运输机制,与其他高等真核生物相似，高度分化的细胞器结构在酵母菌蛋白分泌运输过程中起着重要作用。,酵母菌的蛋白质分泌系统,信号肽及其剪切系统,与其他真核生物相似，酵母菌信号肽序列的保守性较低，大都由15-30个氨基酸
29、残基组成，含有三个不同的结构特征，即N端带正电荷的n区，中间疏水残基的h区，C端极性的c区。,N端带正电荷的n区的长度及氨基酸残基性质各异，都含正电荷。中间疏水残基的h区的疏水氨基酸残基大都随机排列。C端极性的c区具有对应于信号肽剪切位点的特征序列。,分泌型蛋白的糖基化修饰,酵母菌中的蛋白质糖基化修饰有两个主要步骤：,在内质网内腔中的寡聚多糖核装配在高尔基体中的糖外链延伸。,在内质网内腔中的寡聚多糖核装配,在高尔基体中的糖外链延伸,进入高尔基体的分泌型蛋白在其寡聚多糖核上进行外链的延伸反应。酵母菌的修饰形式不同于高等真核生物。重组异源蛋白在酵母菌受体细胞中的超糖基化会造成重组蛋白的生物活性降低
30、以及蛋白质的免疫原性增加等。,第七节、利用重组酵母生产乙肝疫苗,乙肝肝炎病毒的结构与性质,乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染能力的病毒颗粒，直径42nm，基因组仅为3.2kb。病毒的主要结构：蛋白病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化两种形式，颗粒内的蛋白成分包括核心抗原、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。,表面抗原,乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因,产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形
31、式存在，平均颗粒直径为22nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。,整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建,吸附在产品佐剂上形成乙肝疫苗制剂,发酵结束后菌体用玻璃珠机械磨碎，,裂解物经离心分离后,上清液随后进行离子交换层析,超滤,等密度离心,分子凝胶过滤,纯度高达95%以上的抗原颗粒,纯化,第八节、利用重组酵母生产人血清蛋白,人血清蛋白是血浆的主要成分，由肝脏合成，并分泌到血液循环系统中，然后散布于大多数体液中。在临床上，人血清白蛋白主要用作血浆容量扩充剂，抢救休克、烧伤和失血病人，是极为重要的人体蛋白药物，其市场份额占到血浆蛋白的40%。,目前绝大多数厂家是从人血浆或胎盘中分离
32、生产人血清白蛋白的，全世界为此每年要消耗1,000万升人体新鲜血浆和4,500吨胎盘。近年来，这种传统的生产方式受到了利用基因工程酵母发酵重组人血清白蛋白的挑战，因为血浆和胎盘资源毕竟有限，而且最终产品中很可能被血液病原病毒（如乙肝病毒和爱滋病毒）所污染。,由于人血清白蛋白价格低廉（每克只有2美元），需求量大（每年300吨），因此利用基因工程方法大规模生产重组人血清白蛋白能否取代传统的提取方法，很大程度上取决于发酵和分离工序的综合生产成本。,由于人血清白蛋白的临床使用剂量一般都在十几克甚至数十克范围内，这给重组制剂的纯度提出了很高的要求，任何痕量的杂蛋白均可能因为使用剂量的增大而造成严重的免疫
33、反应和毒性反应，这是重组人血清白蛋白开发中的主要难题。,最初采用的重组人血清蛋白表达分泌系统是酿酒酵母。进一步的改进方法是使用乳酸克鲁维酵母作为受体细胞，该菌体杀手毒素蛋白的信号肽能大大提高表达产物的分泌效率。巴斯德毕赤酵母是迄今为止最为优良的重组人血清蛋白的表达分泌系统。,最近，人血清白蛋白与CD4受体的融合蛋白（HSA-CD4）生产工艺已经问世，这种融合蛋白的开发目的是作为人免疫缺陷病毒（HIV）的感染阻断剂使用。,重组可溶性的CD4蛋白已被证明能有效阻止HIV感染CD4+淋巴细胞，但这种重组蛋白在人体内的半衰期极短，很难达到临床治疗所需的浓度。如果人体能耐受高浓度的HSA-CD4融合蛋白，则这种蛋白有望成为一种爱滋病毒的拮抗药物。,人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。,
