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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌能利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例： PCR技术,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,原因：因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA
2、大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,.筛选菌株,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；方法： 抑制大多数微生物的生长 促进目的菌株的生长结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制其他微生物生长。,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖 氮源：尿素,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微
3、生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。,5、培养基选择分解尿素的微生物的原理,允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基,6、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离尿素细菌,判断该培养基有无选择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,找规律：1：判断某个培养基是否具有选择作用时，应设立_培养基进行对照。2：判断所使用的培养基是否被杂菌污染时，应设立_培养基进行空白对照？,基 础,不接该菌种的,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,不
4、能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；,缺点：,2.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,注意事项为了保证结果准确，一般
5、选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,计算公式：,每克样品中的菌株数 =（CV）M,某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml） ( )A. 2.34108B. 2.34109C. 234D. 23.4,B,（三）设置对照,判断培养基的制备是否合格（有无被杂菌污染）：,将未接种的培养基同时进行培养。,判断选择培养基是否具有筛选作用：,完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落
6、数目。,主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：土样不同培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果
7、不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,“微生物的天然培养基”,一土壤取样,数量最大、种类最多,大约70%90%是细菌,取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,（二）样品的稀释,（三）.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度。,还少了什么吗？,未
8、接种的选择培养基,接种的完全培养基,（四）.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,微生物的培养与观察,一无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二做好标记注明培养基种类、培养日期、稀释度等。三规划时间,三、,四.结果分析与评价1
9、.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养基没有发挥选择作用，则菌落形态多样，菌落数偏高。2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功,1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,五.课外延伸,纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨；分布植物的根、茎、叶中；,纤维素生物燃料：最有希望替代石油能源,一
10、、基础知识,1.纤维素,纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。,土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。,2.纤维素酶 纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,一、基础知识,纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%-60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。,在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而
11、人没有分解纤维素的能力。,人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。,3、纤维素的分解,请用一个简单的实验来验证此问题,纤维素酶水解滤纸实验,1U表示1个酶活力单位，是指在温度为25，其他反应条件，如pH等，均为最适的情况下，在1min内转化1mmol的底物所需的酶量。,底物：酶所作用和催化的化合物。,纤维素酶的作用对照实验,（2）纤维素分解菌的筛选,1、筛选纤维素分解菌的方法_。该方法可以通过_反应直接筛选。,刚果红染色法,颜色,2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成_，但不能和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当纤维素被_分解后，红色复合物无法形成，
12、出现以_为中心的_，可以通过_ 来筛选纤维素分解菌。,红色复合物,纤维素酶,纤维素分解菌,透明圈,是否产生透明圈,实验原理,即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌,练一练：,1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是,A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖,2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是,A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D. 若培养基上
13、产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌,(三)、实验设计,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别培养基,挑选菌落,什么样的环境取样?,培养的目的?,挑选什么样的菌落?,鉴别培养基的特点?如何鉴别?,根据：微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；,目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物；,刚果红染色法,对比课题3与课题2实验流程，说说它们的不同之处：,课题2土壤取样，直接稀释。,课题3土壤取样，选择培养，增加纤维素分解菌浓度后，再稀释。,1、纤维素分解菌选择培养基属于_（固体、液体）培养基，原因是_,【资料二】选择培养,阅读资料二“选择培养”，回答以下
14、几问题：,液体,没有添加琼脂,2、该培养基对微生物_（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是_,具有,能分解纤维素的微生物可利用纤维素作为碳源而大量繁殖；其他微生物繁殖被抑制,分布环境,1、土壤取样：,富含纤维素的环境中,操作步骤,生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,原因,将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右的腐殖土壤中。,提示：自变量为培养基的种类，即普通培
15、养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。,A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）,B、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用,说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。,旁栏思考题为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？ 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因
16、此可以起到“浓缩”的作用。,指微生物的种类少了，而某些微生物的数量多了,将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上,将细菌涂布在纤维素粉做主要碳源的选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101107倍。,3.梯度稀释,4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,（1）制备鉴别培养基:,（2）涂布平板： 将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30倒置培养。,鉴别纤维素分解菌的培养基,(水溶性羧甲基纤维素钠),方法一：先 ，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：在 时就加入刚果红。,培养微生物,倒平板
17、,5.刚果红染色法,挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。,两种刚果红染色法的比较：,在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,方法一中NaCl溶液的作用？,思考：,漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这
18、方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！,在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C 370C培养，可获得纯化培养。,6、纯化培养,四、结果分析与评价,1.培养基的制作是否合格 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。,四、结果分析与评价,2.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长
19、则说明培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。3.分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,五、课题延伸,本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。,31为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 发酵产纤维素酶 实验，纤维素酶的发酵方法有 液体 发酵和 固体 发酵。32纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 葡萄糖 含量进行定量测定。,分解纤维素的微生物的分离,纤维素酶,种类、作用、催化,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,扩大培养,鉴别培养,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,刚果红染色鉴别,挑选产生透明圈的菌落,课堂总结,本课题知识小结:,
