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1、Chapter 8沉 析Precipitation,Precipitation什么是沉析？Precipitation method is used to purify the proteins沉析法纯化蛋白质的优点有哪些？The operation procedures of precipitation沉析的一般操作步骤是什么？Salt induced precipitation and its mechanism何谓盐析？其原理是什么？The normal slats used in salt induced precipitation 盐析操作时常用的盐是什么？The affecting
2、elements of salt induced precipitation影响盐析的主要因素有哪些？The mechanism of organic solvent precipitation 有机溶剂沉析法的原理是什么？The affecting elements of organic solvent precipitation影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？The mechanism of isoelectric point precipitation等电点沉析的工作原理是什么？Other precipitation techniques其它常用的沉析方法有哪些？,Knowledge
3、points,何谓沉析？,利用沉析剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。特点：操作简单、经济、浓缩倍数高种类：盐析、有机溶剂沉析、等电点沉析等缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强,一般沉析操作的过程,Step 1 在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂；Step 2 沉淀物的陈化，促进晶体生长；Step 3 离心或过滤，收集沉淀物,盐析(Salt induced precipitation),概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。,The most common type of precip
4、itation for proteins is Salt induced precipitation. Protein solubility depends on several factors. It is observed that at low concentration of the salt, solubility of the proteins usually increases slightly. This is termed Salting in. But at high concentrations of salt, the solubility of the protein
5、s drops sharply. This is termed Salting out and the proteins precipitate out.,盐析原理,首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态：两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞,盐析过程,当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象低盐浓度下，蛋白质溶解度增大（2）“盐析”现象高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够
6、相互靠拢；中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀。,Electric double layer,离子强度对盐析过程的影响,Cohn经验公式S蛋白质溶解度，mol/L;I离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价,，Ks常数,和Ks的物理意义,盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；Ks盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。,Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法；盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析； 其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀
7、现象，因此常用于提取液的前处理。 而盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。,盐析用盐的选择,在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱（Ks）磷酸钾硫酸钠硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁,选用盐析用盐的几点考虑,盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济,常用的盐析用盐,#硫酸铵：溶解度大（25oC，767g/L）(CE p38)硫酸钠磷酸盐柠檬酸盐,影响盐析的因素,溶质种类的影响：Ks和值溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率
8、低；蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量通常调整体系pH值，使其在pI附近；盐析温度：一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降,盐析用盐的用量选择,饱和度（Saturation）的概念：配制饱和硫酸铵溶液（SAS） 1.将 767g (NH 4 )2 SO 4 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液(4.1 mol/L, 25 oC). 2.其它不同饱和度铵溶液的配制,有机溶剂沉淀,概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。原理：传统观点：（1）降
9、低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。新观点：有机溶剂可能破坏蛋白质的某种键，使其空间结构发生某种变化，疏水区暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白沉淀（缺点：蛋白变性）,常用的有机溶剂沉析剂,乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；特点：介电常数小，60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22容易获取,有机溶剂沉析的特点,分辨率高；溶剂容易分
10、离，并可回收使用；产品洁净；容易使蛋白质等生物大分子失活；应注意在低温下操作；成本高,溶剂选择,介电常数要小致变性作用要小（甲醇）毒性要小、挥发性适中水溶性要好,影响有机溶剂沉析的主要因素,温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；搅拌速度：散热溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。（pI）离子强度:离子强度低有利于沉析，0.010.05mol/L样品浓度: 0.52%稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+,等电点沉淀,原理：蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时
11、，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。概念：调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。,由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用操作时的注意事项：（1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低（2）溶质的稳定性（3）盐析效应,其它沉淀法,水溶性非离子型聚合物沉淀剂成盐类复合物沉析剂离子型表面活性剂离子型多聚物沉析剂氨基酸类沉析剂分离核酸用沉析剂分离粘多糖用沉析剂选择性变性沉析法亲和沉析,水溶性非离
12、子型聚合物沉淀剂,PEGThis form of precipitation involves the addition of a non-ionic polymer to the protein solution. This works because the addition of the polymer reduces the amount of water available to interact with the protein. The polymers that have received the most attention have been dextrans and po
13、lyethylene glycols.,成盐类复合物沉析剂,此类沉析剂有以下三种：（1）金属盐：Cu2+，Ag+，Zn2+，Ca2+与酸性基团结合；（2）苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等，与碱性基团结合（3）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性,In this type of precipitation, a metal ion will bind to a part of the protein. An advantage of this type of precipitation is that they have great precipitating power
14、 in a dilute solution. These ions can be classified into three groups. Ions such as Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, and Cd2+ will bind strongly to carboxylic acids and to nitrogenous compounds. Ca2+, Ba2+, Mg2+, and Pb2+ will mainly bind to carboxylic acids. Finally, Ag+, Hg2+, and Pb 2+ will bind str
15、ongly to sulphydryl groups.,金属离子沉析,离子型表面活性剂,十六烷基三甲基季铵盐的溴化物（CTAB）主要用于沉淀酸性多糖十二烷基硫酸钠（SDS）主要用于沉淀膜蛋白和核蛋白,离子型多聚物沉析剂,是一类温和的沉析剂，与目标蛋白成盐。核酸（多聚阴离子），用于碱性蛋白的沉淀；鱼精蛋白（多聚阳离子），用于酸性蛋白的沉淀；,粘多糖沉淀剂,CTAB(十六烷基三甲基季铵盐溴化物)与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络合物析出。,分离核酸用沉析剂,酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。,选择性变性沉淀法,利用蛋白质、酶
16、、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差异，实现分离。加入变性剂选择性热变性选择性酸碱变性使用时需慎重！,亲和沉析,原理：利用蛋白质和特定分子（配基、基质、辅酶等）之间高度专一而设计的一种特殊选择性的分离技术，所以沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，是因为蛋白质与特定分子结合，形成固相从而与杂质分离分类：根据亲和沉淀的机理，分为一次作用亲和沉淀（水溶性分子偶联2个或2个以上的亲和配基，双配基和多配基可与含有2个以上的亲和结合部位的多价蛋白质交联，进而产生较大的交联网络而沉淀）和二次作用亲和沉淀（先使目标物质和带有配基（基质、辅酶）的载体结合，然后改变pH或其它条件使目标物-配基-载体形
17、成可逆性沉淀，从而使目标物与杂质分离(CE p356)。,沉析技术的应用,蛋白质多糖皂苷杜仲中绿原酸的提取,水提醇沉法（水醇法）系指在中药水提浓缩液中，加入乙醇使达不同含醇量，某些药物成分在醇溶液中溶解度降低析出沉淀，固液分离后使水提液得以精制的方法。一般操作过程是：将中药水提液浓缩至11-12（mLg），药液放冷后，边搅拌边缓慢加入乙醇使达规定含醇量，密闭冷藏24-48h，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液。操作时应注意以下问题：药液应适当浓缩，以减少乙醇用量。但应控制浓缩程度，若过浓，有效成分易包裹于沉淀中而造成损失。浓缩的药液冷却后方可加入乙醇，以免乙醇受热挥发损失。选择适宜的醇沉浓度。一般
18、药液中含醇量达50-60可除去淀粉等杂质，含醇量达75以上大部分杂质均可沉淀除去。慢加快搅。应快速搅动药液，缓缓加入乙醇，以避免局部醇浓度过高造成有效成分被包裹损失。密闭冷藏。可防止乙醇挥发，促进析出沉淀的沉降，便于滤过操作。洗涤沉淀。沉淀采用乙醇（浓度与药液中的乙醇浓度相同）洗涤可减少有效成分在沉淀中的包裹损失。,水提醇沉法与醇提水沉法,醇提水沉法（醇水法）系指先以适宜浓度的乙醇提取药材成分，将提取液回收乙醇后，加适量水搅匀，静置冷藏一定时间，沉淀完全后滤除的方法。药材用乙醇为溶剂提取，可避免淀粉、蛋白质、黏液质等成分的浸出，加水处理后可除去醇提液中树脂、脂溶性色素等杂质。应用此方法要慎重，避免醇溶性有效成分因水溶性差而被一起沉淀除去。,本章作业,P63课后思考题1、2、3及：1、常用的蛋白质沉淀方法有哪些？2、简述盐析的原理。3、影响盐析的主要因素有哪些？4、简述有机溶剂沉析的原理。5、简述等电点沉析的原理。,
