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1、分析化学,第十一章 荧光分析法 分析化学教研室,荧光分析法（Fluorometry),概 述,荧光定量分析方法,荧光分析技术与应用,基本原理,小 结,11.1 概述,水溶性荧光黄,荧光分析法：基于对化合物的荧光测量建立起来的分析方法荧光测量包括：荧光谱线位置及荧光强度,续前,荧光分析法与可见紫外吸收光谱比较,荧光分析法分类：根据光源不同进行分类,返回,11.2 基本原理,11.2.1 分子荧光光谱的产生11.2.2 激发光谱与发射光谱11.2.3 分子结构与荧光的关系11.2.4 影响荧光强度的外部因素,11.2.1 分子荧光光谱的产生,一、分子能级与电子能级的多重性,单重态：singlet
2、state,三重态：triplet state,分子的能级包括：电子能级（10ev）、振动能级(0.1ev) 及转动能级(0.001ev) 电子能级的多重性M:M=2S+1；S为总自旋量子数,续前,A：基态单重态 B：激发单重态 C：激发三重态,激发三重态T,激发单重态S*,基态单重态S0,跃迁类型的比较,续前,二、荧光的产生,续前,处于激发态的分子返回到基态共有以下几种途径：,1 2 3 6 4 5,1、振动弛豫（vibrational relexation）,续前,过程：从电子激发态的某一振动能级以非辐射跃迁的方式， 回到同一电子激发态的最低振动能级的过程为振动驰豫特点：发生在同一个电子能
3、级内不同振动能级间的跃迁；时 间约10-12秒。,或,返回,2、内部能量转换（internal conversion),续前,过程：当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠 时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低 电子能级，这种过程称为内部能量转换特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-110-13秒。,或,续前,处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态的最低振动能级过程：振动弛豫内部能量交换振动弛豫,返回,注：,3、体系间跨越（intersystem crossing),续前,过程：处于激发态的电子自旋方向发生改变，而
4、使电子能级的 多重性发生变化的过程特点：激发单重态与激发三重态振动能级重叠时，产生体系间 的跨越（S1*T1 ）。结果：这种跨越会导致荧光强度减弱，甚至熄灭。,续前,影响体系间跨越几率增大的因素：,含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。,在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生几率。,原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运 动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反 转的发生。,返回,4、荧光（fluorescence）,续前,过程：电子由单重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的 任一振动能级而发射的光量子为荧光特点：发生在激发单重态最低振动能级与基态之间
5、。时间约为 10-710-9 s。,注： 发射荧光的能量比吸收的能量小 1 0 即发射波长 激发波长,硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱,激发光谱,荧光光谱,激发光谱,荧光光谱,返回,5、磷光（phosporescence）,续前,过程：电子由三重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的 任一振动能级而发射的光量子为磷光特点：发生在激发三重态最低振动能级与基态之间。分子在三 重态的最低振动能级上可以存活一段时间，发射时间约 为10-410 s。,注： 发射磷光的能量比荧光的能量小 21 0 即磷光波长 荧光波长 激发波长,续前,荧光与磷光的比较,返回,6、外部能量转换（external convers
6、ion),续前,过程：如果分子在溶液中被激发，激发分子之间、分子与溶剂 之间会发生碰撞而失去能量，这种非辐射跃迁的过程称 为外部能量转换特点：发生在激发态的最低振动能级和基态之间；所需时间约 为10-710-9秒。结果：导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭,或,续前,返回,返回2,11.2.2 激发光谱与发射（荧光）光谱,激发波长,发射波长,荧光物质分子的两个特征光谱,激发光谱(excitation spectrum)： F ex,荧光光谱(fluorescence spectrum)： F em,（二）激发光谱与荧光光谱,激发光谱：（与吸收光谱类似）表示不同激发波长的辐射引起 物质发射某一波长荧光所
7、得的光谱。 方法：固定发射光波长em，依次改变激发波长ex，测 荧光强度F，以F-ex作图得荧光物质的激发光谱。,发射光谱：（荧光光谱）固定激发光波长ex，依次改变发射 波长em，测荧光强度F，以F-em作图得荧光光谱。,激发光谱与荧光光谱上的max是定性定量的依据,荧光光谱的特点（重点）,（1）斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发波长。 原因：无辐射跃迁能量损失，包括振动弛豫和内部能量转换等（2） 荧光发射光谱的形状与激发波长无关 原因：电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产 生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能 级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如图)。（3）
8、荧光发射光谱与激发光谱的 镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一 样）成镜像对称关系。,蒽的激发光谱和荧光光谱,镜像关系的原因,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似,返回,11.2.3 分子结构与荧光的关系,1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构：结构中有共轭 *产生的K带， 能吸收紫外-可见光（2）具有一定的荧光效率（）： 荧光效率（）：,荧光效率只能为01荧光效率低的物质可能有强的紫外吸收，但所吸收的能量 以无辐射跃迁的方式释放，不出现荧光发射；,2.分子结构对荧光的关系,（1）跃迁类型： *是强吸收带，电子跃迁几率大，荧光效率高； n
9、*是弱吸收带，电子跃迁几率小，产生的荧光极弱；（2）共轭效应： 提高 *共轭度，有利于增加荧光效率，并产生红移（3）刚性共平面结构： 刚性共平面结构，电子共轭性增加，荧光强度增大。,（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。 给电子基团引入，（-NH2，-OH，-OCH3等），增加共轭程度 吸电子基团引入，（-COOH，-NO2，-Cl 等）， 减弱共轭程度 影响不大：-SO3H，-NH3+，-R，对共轭体系作用较小,返回,续前,返回,1、温度：低温，f。 原因：温度T，分子运动加快， 磁撞几率无辐射跃迁2、溶剂： 溶剂介电常数，极性，n*,E,f， * E,f， 溶剂含重原子或溶解氧（C
10、Br4等)，体系间跨越。 使f，甚至熄灭。 溶剂粘度 ，f，F,11.2.4 影响荧光强度的外界因素,续前,3、pH影响 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；4、荧光熄灭的影响荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄灭的现象。引起荧光熄灭的物质为荧光熄灭剂 常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化 合物、重氮化合物、羰基化合物。,给电子基团,续前,5、散射光的干扰,散射光:当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液， 小部分光线由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方 向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。,瑞利光:光子和物质发生弹性
11、磁撞时，不发生能量交换，仅光子方 向改变，这种散射光称为瑞利光。其波长与入射光相同。,拉曼光:光子和物质发生非弹性磁撞，光子改变方向同时，与物质 有能量交换，散射光波长有所改变，增大或减小，这种散 射光为拉曼光。 波长增大的拉曼光对荧光测定有干扰,硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b),荧光光谱,散射光谱,瑞利光320nm,拉曼光360nm,拉曼光400nm,荧光448nm,激发320nm,激发350nm,瑞利光350nm,返回,11.3 荧光定量分析,2、荧光强度与浓度关系：（稀溶液） 荧光强度F与溶液吸收光能的程度以及溶液中荧光物质的量子效率有关。 若荧光物质浓度很小，满足E
12、cl0.05时，荧光强度与荧光物质浓度成正比,F = k (I0 - I)=KC,1、荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光干扰。,受激后，可在各个方向发射荧光，在透过光的方向不易测定F。,返回,11.4 荧光分析技术及应用,1、荧光仪器简介：四个部分：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。,（1）光电荧光计,高压Hg灯，产生线光谱,将不需要的光滤去,低荧光的玻璃或石英制成，四面透光。,只让荧光照射到检测器上,续前,（2）荧光分光光度计,固定激发波长ex ，扫描荧光光谱，找荧光光谱max 。固定荧光光谱max，扫描激发光谱，找激发光谱max 。固定激发光谱max 。扫描荧光光谱，找荧光光谱max 。,续前,（3）荧光光电计与荧光分光光度计的比较,返回,小结：,掌握基本概念：荧光、振动弛豫、内部能量转换、外部能量转换、体系间跨越及磷光；激发光谱与荧光光谱基本理论：溶液荧光光谱的特征；物质发射荧光的条件；荧光定量分析的依据、条件及方法熟悉：影响荧光强度的因素（分子结构和外界条件）了解荧光分析仪器,练习：,P297，思考题 3、5，8,
