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1、第二章 分子克隆常用工具酶,Tel: 87286939 Office: 园林楼620,每一单链具有 5-3极性 两条单链间以氢键连接 两条单链，极性相反，反向平行 以中心为轴，向右盘旋,Structure and features,DNA 的基本结构,Replication,分子克隆操作过程： 克隆目的基因将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成重组DNA导入宿主细胞筛选、鉴定扩增和表达。,工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。 要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonu
2、clease）；要把不同片段连接起来，需要DNA连接酶（ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要 DNA 聚合酶（polymerase）等。 因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。,核酸水解酶类,核酸合成酶类,核酸修饰酶类,核酸内切酶核酸外切酶,DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶,磷酸酶核苷酸激酶核苷酸转移酶甲基化酶,限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶,用于核酸操作的常用工具酶,9,大家有疑问的，可以询问和交流,可以互相讨论下，但要小声点,常用的工具酶性质及功能,第一节 分子克隆最常用两个工具酶,限制性内切酶 Restriction enzymes,限制
3、性内切酶是一种能识别 DNA 上特定碱基组成的序列并在这些序列位点上切断DNA分子水解磷酸二酯键的一种内切核酸酶。,一、限制性核酸内切酶的分类,二、 限制性核酸内切酶的命名原则,名 属 种 株 序 菌株来源 称 名 名 名 号EcoR E co R Escherichia coli R Hind H in d Haemophilus influenzae d Hind H in d Haemophilus influenzae d Hpa H pa / Haemophilus parainfluenzaea,Hind 代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzae) d 株中
4、分离到的第3个限制酶。,一般分子量为60kd，单链多肽，最适 pH 为 68 NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用 对热不稳定，通常贮存于20环境。为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有50甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。,三、限制性核酸内切酶学特性,每一种酶都有各自特异识别位点,它对底物要求有特异的序列，通常的识别序列是4 bp 6bp，有些则为7bp8bp，甚或多于8bp。 多数限制酶的识别序列为回文结构，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。,不同限制性内切酶切割的三种结果,同尾酶, 温度：一般37 盐离子浓度：Na，Mg2 缓冲体系：具
5、有稳定 pH 环境的Tris-HCl缓冲体系 DTT用于保持酶 稳定性和活性 反应体积和甘油浓度： 商品化的限制性内切核酸酶均加50甘油作为保护剂，一般在-20保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10，否则甘油浓度过高，影响酶切反应 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜 DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、 RNA等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链DNA，DNA的甲基化位置会影响酶切反应。,四、影响酶切反应的条件*,II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系,“星”活性Star activity,“星”活性：高浓度的酶、高浓度
6、的甘油、低离子强度、极端ppH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。 在名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoR*：AATT ；EcoR：GAATTC 必须采用规范的实验步骤, 应用推荐的反应条件。,位点偏爱（site preference） 某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。,第二节 DNA连接酶 DNA Ligase,定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3羟基和5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来功能：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用。,一、DNA连接酶性质
7、,两种DNA连接酶比较,二、常用连接酶,连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15以下，然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是37但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷，所以连接反应一般采用16过夜。,三、DNA连接酶的反应条件,DNA浓度：外源片段浓度比载体DNA浓度高5-10倍 由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多，故在平末端连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要求较高。防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体时间：过夜最好,1）粘性末端DNA片段的连接,直接用T4
8、 DNA连接酶连接：效率不高，较少采用。同聚物加尾连接平末端DNA片段：先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA连接酶进行连接用衔接物连接平末端DNA分子：目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接,2)平末端DNA片段的连接,应用互补同聚物加尾法连接DNA片段,用衔接物分子连接平末端的DNA片段,衔接物：指用化学方法合成的一段由若干个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段,四、重组DNA实验的一般程序,选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶（如EcoR I）作位点特异的切割
9、，形成全长的具粘性末端的线性DNA分子再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化。混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoR I）粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子。,第二节 其他分子克隆工具酶,一、DNA 聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶IK1enow片段T4 DNA聚合酶Taq DNA聚合酶逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶RNA聚合酶,依赖于DNA的DNA聚合酶,用途：DNA缺口平移中标记DNA探针,大肠杆菌DNA聚合酶I,以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双链DNA分子的 3-OH 端而合成新的 DNA.,基
10、本用途,大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment),大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow 酶。 Klenow 酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了5 3的核酸外切酶活性。,有35的核酸外切酶活性和 53的DNA聚合酶活性。在无dNTP时，可以从任何 3-OH端外切,T4 DNA 聚合酶 (T4 phage DNA polymerase),基本用途,Taq DNA聚合酶是从栖热水生菌(Thermus aquaticus)中分离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶，最适温度75-80需要Mg2+(10 mmol
11、L)，在低浓度Mn2+(2 mmol/L)中有低活性，Ca2+使其完全失活，一价阳离子高至0.1 moIL对活性无影响，而最适浓度NaCl为40 mmol/L，KCl为60 mmol/L最适pH7.8(Tris-HCl)，与大肠杆菌DNA聚合酶相比，其最大特性是耐高温和无核酸酶活性,Taq DNA聚合酶,催化RNA体外合成反应依赖 DNA 的 RNA 聚合酶不依赖 DNA 的RNA聚合酶,RNA聚合酶,反转录酶(reverse transcriptase),反转录酶具有53的DNA聚合酶活性，以RNA为模板聚合cDNA链,同时又具有3 5和5 3的 RNA 外切核酸酶活性。AMV和MLV。,主
12、要用途：转录 mRNA 成为 cDNA 制备基因片段,双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,DNA 和 RNA的修饰酶,核酸酶SI碱性磷酸酶磷酸激酶末端脱氧核苷酸转移酶甲基化酶,1）单链核酸酶SI,功能： 降解 ssDNA 或 ssRNA 形成 5-磷酸末端的单或寡核苷酸片段。,应用：分析DNA：RNA杂交体结构（S1 mapping）。确定内含子部位。切除DNA片段上的单链末端，形成平末端. 切开 cDNA 合成过程中形成的发夹环在限制酶位点上产生小缺失,Rnase 和 DNase,RNase-Free DNase 是一种DNase I（核酸内切酶）， 可以降解双链或单链 DNA。,RN
13、ase H： 特异性地水解杂交到 DNA 链上的 RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。 RNase A：广泛应用的核酸内切酶。对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。,Rnase 酶非常稳定，常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。 DEPC 处理。,碱性磷酸酶,功能：催化去除 DNA、RNA 上的 5 端磷酸基团, 从DNA片段上除去5磷酸以防自身连接。用途：在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接。,Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP),磷酸激酶
14、,T4-多核苷酸磷酸激酶,末端脱氧核苷酸转移酶,功能：在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核苷酸，沿着5到 3加到 DNA 链的 3-OH 末端。该过程不需要DNA模板，对双链、单链 DNA 都适用。经常用于人工粘性末端的构建。,末端脱氧核苷酰转移酶(TDT),甲基化酶,原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。 Dam 甲基化酶可在 GAmTC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。受其影响的酶有Bccll II、MbbooII等。 Dcm 甲基化酶识别 CCmAGG 或 CCmTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。受其影
15、响的酶有EccooR IIII等,基因工程中常用的工具酶,思考题：,载体构建的工具酶主要有那些类型？限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、宿主的限制与修饰。核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响其酶活性的因素。T4 DNA连接酶的性质及用途.Klenow 酶的基本性质及用途。其他工具酶的用途。,练 习 题,1. 一种DNA分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果： EcoRI 5kb EcoRI/HindIII 1、2、3、4kb HindIII 3kb 、7kb EcoRI/PstI 2、3、5kb PstI 10kb HindIII/PstI 1、3、6kb 将各限制酶位点绘制在
16、DNA分子上。2.另一DNA分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在DNA分子上。 EcoRI 1、3、6kb EcoRI/HindIII 1、3kb HindIII 4、6kb EcoRI/PstI 1、3、5kb PstI 2、8kb HindIII/PstI 2、6kb 3.下图中的一段DNA分子上有两个限制酶PstI和EcoRI识别位点，两位点相距10bp，现有一研究生要分析EcoRI右侧500bp区域内的功能，他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能区，他应如何设计此实验？假定EcoRIPstI间的10bp除去后并不影响任何结果分析，但PstI位点左侧的DNA不能除去,
17、4. 假如PstI位点为另一限制酶HindIII，实验又该如何设计？ 5. 现有一研究者打算将一EcoRI DNA片段克隆到一个DNA分子的 BamHI 位点以便 DNA 扩增，但扩增后的 DNA 分子又可用BamHI 限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。 6. 一研究生要将一质粒（pI）上的BamHI-HindIII片段取代另一质粒（pII）上的BamHI-XbaI片段，所获重组质粒（pIII）上的插入片段要求能用BamHI-HindIII进行回收，问如何设计此实验？,7. 现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示： 已知HindIII克隆片段中的BamHI（3kb）片段含
18、有一完整的基因编码区，现要将此3kb的BamHI片段克隆到另一表达载体pB的BamHI位点，如何才能使插入片段与表达载体中的基因处于相同的阅读框架？如何证明插入基因的转录方向是相同的？,8. 为了检测绿豆核酸酶对5-端突起的单链DNA切割是否准确有效，即该酶只除去单链而不损伤双链区。有一研究者设计了一套非常精巧的实验，其中一个实验是将一XbaI片段插入pBR322的Apr基因内的ScaI位点使该基因失活，然后再经一系列实验证明绿豆核酸酶的作用确实与预期的结果一致，你能否设计出这一套实验？(pBR322除含有Apr基因外，还含有Tcr基因)。,9. 某研究者计划将具有限制酶BamHI粘性末端结构
19、的一段低聚核苷酸分子插入到一载体的克隆位点区。现假设他已获得具有低聚核苷酸插入的重组质粒，他应做什么实验来检查插入片段的方向,ScaI,XbaI片段,Tcr（当有外源DNA插入， 该基因失活）,pBR322,Apr,Tcr,图中字母代表的意义：N-NotI；Sp-SpeI；SI-SacI；Sf-SflI；H-HindIII；B-BamHI； Xb-XbaI；S-SalI；K-KpnI；E-EcoRI,10. 一DNA分子中有一个SmaI识别位点(CCCGGG), 现有一研究生想要将这识别位点顺序完全除去,现已知该位点及两侧的序列为ACCCGGGT,他应该如何设计实验? 11. 一研究者想在下列
20、三种限制酶位点的BamHI中插入另外一段低聚核苷酸,该段低聚核苷酸中的限制酶位点如下所示, 要求获得的重组DNA分子的各种限制酶位点按一种方式排列, 他应如何设计实验分离到所需的DNA分子?,EcoRI BamHI HindIII BamHI SmaI SacI EcoRI PstI BamHI + E B P E SI Sm B H 12. 如何使下列的限制酶识别位点由一种序列变为第二种, 或由第一种变为第三种? GATC GATATC GATCGATC； TCGA TCGCGA TCGCGCGCGA； Sau3AI EcoRV ClaI TaqI REII BssHI AAGCTT AAGCGCTT HindIII ThaI，HaeII13.下图的质粒载体中的四环素抗性基因内有一BamHI位点, 一研究者想用体外缺失或插入的办法使BamHI位点消除, 并获得如图所示的重组质粒，他应如何设计此实验? 假定密码子的增减对基因的抗性无任何影响。,0.5kb,Tcr,
