第七章吸光光度法ppt课件.ppt

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1、,第七章 吸光光度法,Analytical Chemistry,2,吸光光度法 基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。,分类：红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围2.51000 m ,主要用于有机化合物结构鉴定。紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200400 nm（近紫外区） ，可用于结构鉴定和定量分析。可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400760 nm ，主要用于有色物质的定量分析。,特点： 灵敏度高，用于测定微量或是痕量组分；准确度高；测定快。,Analytical Chemistry,3,7.1 吸光光度法基本原理,7.1.1 溶液的颜色和对光的选择性吸收

2、,1. 光的基本性质光是一种电磁波，具有波粒二象性。 光的波动性可用波长、频率、光速c等参数来描述,光的粒子性可由能量E来描述 E = h = h c / （普朗克常数：h=6.626 10-34 J. S ) 光的波长越短（频率越高），其能量越大。,Analytical Chemistry,4,光是一种电磁波，电磁波根据波长或频率排列可得如下电磁波谱,Analytical Chemistry,5,Analytical Chemistry,6,单色光：只具有一种波长的光（由具有相同能量的光子组成）； 复合光（白光）：由不同波长的光组成的光； 互补色光：将两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合，

3、可得白光，将这两种单色光称互补光。,光的互补示意图：,Analytical Chemistry,7,2. 溶液的颜色和对光的选择性吸收,当光照射到物质时，由于物质对不同波长的光的反射、散射、折射、吸收、透射的程度不同，使物质呈现不同的颜色。一般来说，物质所呈现的颜色是其所吸收光的互补色。,物质的颜色与光的关系,完全吸收,完全透过,吸收黄色光,光谱示意,表观现象示意,复合光,Analytical Chemistry,8,3. 吸收光谱曲线(1)物质对光对吸收有选择性,物质吸收黄光，透过蓝光：CuSO4吸收黄光，显蓝色。,(2)吸收光谱 测量某种物质对不同波长单色光的吸收程度不同，以波长为横坐标，

4、以吸光度为纵坐标，可得一条曲线。它描述了物质对光的吸收情况。,Analytical Chemistry,9,吸收曲线的讨论,同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max;不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，max不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则不同;,不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在max处吸光度A 的差异最大;此特性可作为物质定量分析的依据;在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,Analytical Chemistry,10,7.1.2 光的吸

5、收定律(The Lambert-Beers law),1、透光度和吸光度 当一束平行的单色光垂直照射到并通过一均匀的非散色的介质(g、l or s)时，介质对光的吸收程度为吸光度A，而透光度为T，则: A = lg (I0 / It )= - lgT T = It / I0 T越大，介质对光的吸收程度越小，A越小,T 取值为0.0 % 100.0 %,全部吸收,T = 0.0 %,全部透射,T = 100.0 %,Analytical Chemistry,11,实验证明：溶液吸光度A的大小与液层厚度b、溶液的浓度c有关。 A= lg 1/T= lg Io/It=abc-朗伯-比尔定律A-吸光度

6、;T-透光度;I0-入射光强度;It-透射光强度;b-液层厚度;c-溶液浓度;a-吸光系数,与溶液种类和I0有关.,朗伯比尔定律：当一束平行的单色光垂直照射到并通过一均匀的非散色的溶液时，溶液对光的吸收程度A与溶液的浓度c及液层厚度b成正比。,Analytical Chemistry,12,摩尔吸光系数()的讨论,1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，可作为定性鉴定的参数；2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；3）同一吸收物质在不同波长下的值是不同的。在最大吸收波长max处的摩尔吸光系数，常以max表示。max表

7、明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。,Analytical Chemistry,13,摩尔吸光系数()的讨论,4）max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。 105：超高灵敏； =(610）104 ：高灵敏； 2104 ：不灵敏。5）在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。6）光吸收定律不仅适用于物质对可见光的吸收,也适用于紫外光和红外光的吸收,不仅适用于均匀的非色散溶液,也适用于气体和均匀物质。,Analytical Chemistry,14,2. 吸光度A的加和性,若溶液中含有不止一

8、种吸光物质，则总吸光度等于各个组分吸光度之和： A=A1+A2+.+An,3.A与T之间的关系：,Analytical Chemistry,15,4.朗伯-比尔定律的适用条件,(1) 单色光 应选用max处或肩峰处测定(2) 吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系 应控制条件(酸度、浓度、介质等)(3) 稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强,Analytical Chemistry,16,例7.1 有一浓度为 的有色溶液，在430nm处的摩尔吸光系数为 。若液层厚度为1.0cm，计算其吸光度和透光率。,解:,Analytical Chemistry,17,例7.2 用邻二氮菲光度法测定

9、铁.已知 浓度为 ,液层厚度为2.0cm,在波长510nm处测得吸光度为0.38.计算邻二氮菲亚铁的摩尔吸光系数 .,解:,Analytical Chemistry,18,7.2 分光光度计,分光光度计种类和型号繁多,但基本部件由下列五部分组成:,光源,单色器,吸收池,检测器,显示记录系统,光源：要求光源有足够的发光强度而且强度稳定。 可见光区：钨丝白炽灯 紫外区： 氘灯,Analytical Chemistry,19,单色器：单色器的作用是从光源发射出的复合光中分出某一波长的高纯度入射单色光。常用的单色器由入射狭缝、准直镜、色散元件(棱镜或光栅)、聚焦透镜和出射狭缝组成，关键部件是色散元件。

10、棱镜(利用光的折射作用):玻璃棱镜(可见光区),石英 棱镜(紫外光区)光栅(利用光的干涉作用):波长范围宽,色散均匀,分 辨性能好,使用方便,Analytical Chemistry,20,吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。 可见光区：玻璃比色皿（吸收UV） 紫外区：石英比色皿（不吸收UV）检测器：利用光电效应,将光强度信号转换成电流讯号。检测器应具有灵敏度高、响应时间短、响应线性范围宽并对不同波长的光有相同的响应等特点。 光电池，光电管，光电倍增管记录显示系统：由检测器产生的光电流的大小常用检流计或微安表反映出来。用检流计或微安表显示时要注意标尺：等刻度标尺是百分透光度,不等分刻度为吸

11、光度,见书上P157图7-6. 低档仪器：刻度显示 中高档仪器：数字显示,自动扫描记录,Analytical Chemistry,21,7.3 吸光度的测定,7.3.1 吸光度的测定分光光度计的检测器将光信号转变为电信号,所以记录显示器显示的只是与照射在检测器上的光强度I成正比的光电流的大小。设通过被测溶液的入射单色光强度和透射光强度分别为I0和It,则：i0=KI0;it=KItit/i0=It/I0=T, A=lg(1/T),因此在使用单光束分光光度计测定溶液的吸光度时,必须首先做空白测定.,由于比色皿、溶剂及与被测成分共存的其他物质对光有吸收、色散等作用,故实际工作中要用参比溶液做空白测

12、定,以减少比色皿、溶剂等因素对测定的影响。,Analytical Chemistry,22,测得溶液吸光度后可用下列方法求算溶液浓度：,1.工作曲线法 (标准曲线法):,配制一系列浓度不同的标准溶液,在相同条件下测定各标准溶液的吸光度。绘制A-c“工作曲线”。再用相同方法测出待测溶液的吸光度Ax,根据Ax可在工作曲线上查出待测液的浓度cx。标准曲线法适于批量试样的分析。,标准工作曲线图,Analytical Chemistry,23,2.标准比较法:,配制合适浓度的标准溶液(cs)和待测溶液(cx), cx与cs应尽量接近以减少读数误差。在相同条件下显色,并且在相同条件下分别测定两溶液的吸光度

13、As和Ax。由于是同种物质的溶液,据朗伯-比耳定律可得：,因为：,所以：,Analytical Chemistry,24,7.3.2 测定误差及测定条件的选择,1.吸光光度法测定的误差,吸光光度法测定的误差主要来源于两个方面：对朗伯比尔定律的偏离及光度测量误差。,(1) 偏离Lambert -Beer定律引起的误差,依据Beer定律，A与c关系应为经过原点的直线偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面,a. 光学因素b. 化学因素,Analytical Chemistry,25,a.光学因素-非单色光的影响,Beer定律应用的重要前提-入射光为单色光,照射物质的光经单色器分光后并非真正单色

14、光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应,必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度,Analytical Chemistry,26,Analytical Chemistry,27,讨论：,结论：选择较纯单色光（，单色性） 选max作为测定波长（）,Analytical Chemistry,28,b. 化学因素,溶液对光的吸收偏离朗伯比耳定律的另一个原因是溶液中吸光质点间的相互作用。 朗伯比耳定律的基本假设之一是吸光质点是独立的。但实际上溶质分子、溶剂和溶质分子有缔合、离解和互变异构等现象,这些分子或微粒除对特定波长光有吸收外,尚有反射、散

15、射等现象发生(特别是被测液为胶体、乳浊液或悬浮液时，反射、散射会更严重),这些因素使透光度减少,出现正偏差。,Analytical Chemistry,29,(2)仪器测量误差,任何光度分析仪器都有一定的测量误差。这是由于光源强度不稳定、单色器分辨波长能力弱、比色皿透光度不一致、透光度和吸光度标尺不准等因素引起的。对于给定的光度计来说,透光度或吸光度的读数误差是决定测定结果准确度的主要因素。,T=0.01-0.02,Analytical Chemistry,30,浓度测量的相对误差与T(或A)的关系,浓度相对误差不仅与仪器的读数误差有关,而且与试液本身的透光度也有关。透光度较高或较低时,测量的

16、相对误差都较大,一般当A=0.2-0.8 (T=15一65)范围时,浓度测定的相对误差较小,而吸光度为0.434时测定误差最小。,Analytical Chemistry,31,2. 测定条件的选择,根据对吸收光谱的讨论和对测量误差的分析,为了使分光光度法有较高的测量准确度和灵敏度,应正确选择测量条件：,(1)选择合适波长的入射光。合适波长是指在干扰最小的情况下能取得灵敏度最高的测量结果的入射光波长。在无干扰的情况下,一般选择最大吸收波长的光为入射光。,(2)选择合适的吸光度范围(A=0.20.8)。通过改变c或b,Analytical Chemistry,32,(3)选择适当的参比溶液,调节

17、仪器的零点,消除由比色皿、溶剂及试剂对入射光的吸收和反射等带来的误差。溶剂空白:当试液、显色剂和其他试剂在测定波长下均无吸收时,可用纯溶剂(或蒸馏水)作参比溶液;试液空白:当在测定波长处,显色剂无吸收,而待测液中共存的其他离子有吸收时,采用不加显色剂的待测试液作参比溶液；试剂空白:当待测试液无色而其他试剂、显色剂有色时,则不加待测试液,按操作步骤加入显色剂和其他试剂配制成参比溶液。,Analytical Chemistry,33,7.4 显色反应,在可见光区测定无色或颜色很浅的物质时,须首先利用显色反应把待测组分X 转变为有色化合物,然后再进行测定。使试样中的被测组分与化学试剂作用生成有色化合

18、物的反应叫显色反应。这种化学试剂叫显色剂。mX(待测物)nR(显色剂)XmRn(有色化合物),显色反应主要有配位反应和氧化还原反应，其中绝大多数是配位反应。,Analytical Chemistry,34,7.4.1 吸光光度法对显色反应的要求,灵敏度高 选择 较大(104105)。选择性好 显色剂只与被测组分反应。有色物组成固定有色物稳定性高 其它离子干扰才小。如三磺基水杨酸铁的Kf =1042 , F-、H3PO4对它无干扰。显色过程易于控制,重现性好 有色化合物与显色剂之间的颜色差别应尽可能大。,Analytical Chemistry,35,7.4.2 影响显色反应的因素,1. 显色剂

19、用量:为保证反应完全,R过量,但不宜过多.,2. 溶液的酸度:影响各物种存在型体,3. 显色温度:一般室温完成,有些要加热.,4. 显色时间:有的要10-30min,有些瞬间完成;有的稳定30min,有的稳定60-120min.,5. 溶剂:有机溶剂常降低有色化合物的离解度,使颜色加深,提高显色反应的灵敏度,分别做单因素试验确定各因素的最佳值.,Analytical Chemistry,36,(1)无机显色剂：与金属离子生成的化合物不够稳定,灵敏度不够高,选择性也不太好,目前已经很少应用。尚有实用价值的有: SCN - Fe3+，MoV ，Co2+ MoO42- Si，P，V，Ge，As H2

20、O2 Ti TiO(H2O2)2+(2)有机显色剂:许多有机显色剂与金属离子生成稳定的螯合物,具有鲜明而有特征的颜色,反应灵敏度较高,选择性较好,应用较为广泛。 双硫腙(H2D2), 二甲酚橙(XO), 偶氮胂(), 铬天青(CAS),7.4.3 常用显色剂,Analytical Chemistry,37,7.5 吸光光度法的应用,7.5.1单组份测定,被测试样溶液中只含一种组分，或者在混合物溶液中被测组分的吸收峰与共存物质的吸收峰无重叠，均视为单一组分试样。在这些情况下，一般可选择被测组分的最大吸收波长max处进行测定。若被测组分有若干个吸收峰，应选择吸光度随波长变化较小的波长进行测定。单组

21、分的定量分析方法有工作曲线法、标准对照法等。,Analytical Chemistry,38,标准曲线法,Analytical Chemistry,39,例如：芦丁含量测定,Analytical Chemistry,40,标准对照法（比较法）,若试样中只有被测组分在 max 处有吸收，且符合朗伯-比耳定律，则配制一与待测样品浓度接近的标准溶液，在相同条件下显色，在同一波长处测定吸光度，根据下式可计算出待测样品的浓度。,Analytical Chemistry,41,7.5.2 多组分分析,当溶液存在两种或两种以上待测组分时，用分光光度法可同时测定。若溶液中存在两种组分x和y，它们的吸收光谱一般

22、可有如下两种情况。,Analytical Chemistry,42,2吸收光谱重叠。当组分x和组分y的吸收光谱重叠时,可选定两组分吸光度相差较大的波长1和2，测定吸光度。若各组分的吸光性能符合比耳定律，则其总吸光度为各组分吸光度之和（吸光度加和性），在波长1和2处测定吸收度A1和A2，可得到如下联立方程：,1吸收光谱不重叠。吸收光谱不重叠或至少能找到在波长1时x有吸收而y不吸收，在波长2时y有吸收而x不吸收，此时可在波长1处测定x的含量，可在波长2处测定y的含量，相互不干扰。,式中，cx，cy分别为x和y的浓度，x1，y1分别为x和y在1处的摩尔吸光系数，x2，y2分别为x和y在2处的摩尔吸光

23、系数。摩尔吸光系数可以分别用x和y标准溶液在波长1和2处测定吸光度后求得。将摩尔吸光系数代入联立方程，解联立方程可求出两种组分的浓度。解联立方程组法也可用于溶液中两种以上组分的同时测定，但是测量组分增多，分析结果的误差也增大。,Analytical Chemistry,43,10.5.3 示差分光光度法,普通的光度法广泛应用于微量组分的测定，对于常量或高含量组分的测定无能为力，这是因为当待测组分浓度高时会偏离朗伯-比耳定律，也会因测得的吸光度值超出适宜的读数范围产生较大的测量误差。若采用示差分光光度法（简称示差法），则能较好地解决这一问题。示差法与普通光度法的主要区别在于它们所采用的参比溶液不

24、同。示差法采用一适当浓度（接近试样浓度）的标准溶液作参比进行测量。,设待测溶液的浓度为cx，标准溶液浓度为cs（cscx）。示差法测定时，首先用标准溶液cs作参比调节仪器透光度 T 为100 %（A = 0）。然后测定待测溶液的吸光度，该吸光度为相对吸光度A，根据朗伯-比耳定律有：,Ax=abcx As=abcsA=Ax-As =abcx -abcs=abc,Analytical Chemistry,44,上式表明示差法所测得的吸光度实际上相当于普通光度法中待测溶液与标准溶液吸光度之差A，A与待测溶液和标准溶液的浓度差c呈线性（正比）关系。若用cs为参比，测定一系列c已知的标准溶液的相对吸光度

25、A，以A为纵坐标，c为横坐标，绘制A-c工作曲线，即示差法的工作曲线。再由测得的待测溶液的相对吸光度A，即可从工作曲线上查得相应的c，根据cx=cs+c计算得出待测溶液的浓度cx。,应用示差法时，要求仪器光源有足够的发射强度或能增大光电流的放大倍数，以便能调节示差法所用参比溶液的透光度为100%。因此，示差法要求仪器具有质量较高的单色器和足够稳定的电子系统。,Analytical Chemistry,45,示差法标尺扩展原理,设普通光度法中，浓度为cs的标准溶液的透光度Ts为10 %，而示差法中该标准溶液作为参比溶液，其透光度调至Tr=100%（A = 0），这相当于将仪器透光度标尺扩大了10倍。若待测溶液cx在普通光度法中的透光度为Tx=5 %，则示差法中将是Tr = 50 %，此读数落在透光度的适宜范围内，从而提高了c测量的准确度。,