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1、第10章 吸光光度法,吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收的分析方法(1)比色法(2)可见分光光度法（visible spectrophotometry）(3)紫外分光光度法（ultraviolet spectrophotometry）(4)其他,特点：,(1)具有较高的灵敏度，适用于微量组分的测定。(2)通常所测试液的浓度下限达10-510-6 molL-1。(3)吸光光度法测定的相对误差约为2%5%。(4)测定迅速，仪器操作简单，价格便宜，应用广泛(5)几乎所有的无机物质和许多有机物质的微量成分都能用此法进行测定。(6)还常用于化学平衡等的研究。,10.1 物质对光的选择性吸收 和光吸收的
2、基本定律10.1.1 物质对光的选择性吸收 1.光的性质:波粒二相性；2.物质的颜色:单色光具有同一波长的光 复合光由不同波长组成的光 物质的颜色对不同波长的光具有选择性吸收的结果。互补色光两种对应颜色(波长)的光按一定比例混合后可 得白光。,3.吸收光谱的产生:原子吸收光谱原子外层电子选择性吸收电磁波而引起,为线状谱。分子吸收光谱价电子跃迁产生的分子光谱，为带状谱。电子能级紫外、可见光谱；包括若干振动能级；1-20eV，200-750nm 振动能级红外光谱；包括若干转动能级；0.5-1eV,750nm 转动能级红外光谱,750nm,10.1.2 光的吸收基本定律 朗伯-比耳（Larnbert
3、-Beer）定律,1.朗伯比耳定律 吸光度与液层厚度 Ab 吸光度与物质浓度 A c A c b,单位截面内吸光质点使光强度减弱,光质点与浓度的关系,式中 A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；c：溶液的摩尔浓度，单位 molL-；：摩尔吸收系数，单位 Lmol-cm-；常用表示。或:A=lg(I0/It)=a b c c：溶液的浓度，单位gL-a：吸收系数，单位Lg-cm-a与的关系为：a=/M（M为摩尔质量）,朗伯比耳定律数学表达式,朗伯-比耳定律成立的前提：,(1)适用于所有的电磁辐射和所有的吸光物质（气体、固 体、液体、原子、分子和离子）；(2
4、)入射光平行单色且垂直照射；(3)吸光物质为均匀非散射体系；(4)吸光点之间无相互作用；(5)辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和 化学现象发生,透过度T:描述入射光透过溶液的程度 T=I/I0吸光度A与透射比T 的关系:,透射比T,(1)吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。(2)摩尔吸收系数在数值上等于浓度为1 mol L-1、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度；(3)吸光度具有加和性。,（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；（2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；（3）同一吸收物质在不
5、同波长下的值是不同的。在最大吸收波长max处的摩尔吸收系数max表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。,摩尔吸收系数的讨论,（4）可作为定性鉴定的参数；（5）物质的吸光能力的度量 max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。105：超高灵敏；=(610）104：高灵敏；=104 103：中等灵敏；103：不灵敏。（6）在数值上等于浓度为1 mol L-1、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。,摩尔吸收系数的讨论,桑德尔灵敏S,光度计的检测极限A=0.001，此时检测到的是该物质的最低浓度为Cmin。定义：单位截面积光
6、程内所能检测出的吸光物质的最低含量，即 S=Cminb 不同波长下 的S不同，在最大波长max下的桑德尔灵敏度能反映测定某物质所能达到的最大灵敏度。根据朗伯-比尔定律：Cminb=A/=0.001/S=Cminb=0.001/M 10-3106 S=M/(ug/cm2),10.2 分光光度计及吸收光谱,光源,单色器,比色皿,检测器,显示装置,10.2.1 分光光度计,1.光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。,可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3202500 nm。紫外区：氢、氘灯。发射185400 nm的连续光谱。,2.单色
7、器,将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任意波长单色光的光学系统。入射狭缝：光源的光由此进入单色器；,准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；色散元件：将复合光分解成单色光;棱镜或光栅,3.样品室,样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。,4.检测系统,将光强度转换成电流来进行测量。光电检测器。要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。(1)光电管,(2)光电二极管阵列,电容器再次充电的电量与每个二极管检测到的光子数目成正比，而光子数又与光强成正
8、比。通过测量整个波长范围内光强的变化就可得到吸收光谱。,电容器充电,电容器放电,光照射,再次充电,测量周期,10.2.2 吸收光谱,分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同。用不同波长的单色光照射，测吸光度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标制作吸收光谱（吸收曲线）与最大吸收波长 max；,1.吸收曲线的讨论,（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max。,（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，max不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则不同。,（3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。,（4）不同浓度
9、的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在max处吸光度A 的差异最大,所以测定最灵敏，选择入射光波长的重要依据。此特性可作为物质定量分析的依据。,（5）吸收光谱的作用：选择max为测定波长。,（6）吸收光谱的制作：用不同波长的单色光照射，测吸光度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标制作。,2.参比溶液的选择,为什么需要使用参比溶液？测得的的吸光度要能真正反映待测溶液吸光强度。,待测物质溶解在溶剂中，盛放在比色皿中，测定时因为比色皿和溶剂对光的吸收、反射和散射作用，使光部分损失，透视率减小，增加了Ar，此时测定的A溶液=A试样+Ar，不与试样浓度成正比，需要校正。配制参比溶液，测定其吸光度
10、，使A参比=Ar，则A试样=A溶液-A参比 若人为将参比的吸光度调节为零，A试样可以直接读出。,选择参比溶液所遵循的一般原则：若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其他所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液；,若显色剂或其他所加试剂在测定波长处略有吸收,而试液 本身无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液；,若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可 用“试样空白”(不加显色剂)作参比溶液；若显色剂、试液中其他组分在测量波长处有吸收，则可 在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。,(5)改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，作 为
11、参比溶液消除干扰。,10.3 显色反应及其影响因素,10.3.1 显色反应与显色剂,1.显色反应的选择:a.选择性好；灵敏度高（104）；b.化学组成恒定，符合一定的化学式；c.有色化合物的组成与性质稳定；d.有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大；,如Mn（）在紫外或可见光区本身有较深的颜色，可以直接进行测定。,2 显色剂,无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵等。有机显色剂：a.磺基水杨酸 b.丁二酮肟 c.邻二氮菲 d.二苯硫腙偶氮类显色剂：性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大，应用最广泛。偶氮胂III、PAR等。三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等,3.多元络合物：三种或三种以上组分形成的络
12、合物 a.三元混配络合物 由一种金属离子同时与两种不同的配位体形成的三元配合物。例:Ti-EDTA-H2O2三元配合物的稳定性，比Ti-EDTA和Ti-H2O2二元配合物的稳定性，分别增强约1000倍和100倍。b.离子缔合物 c.金属离子-络合剂-表面活性剂,10.3.2 影响显色反应的因素 1.酸度:a.对显色剂的平衡浓度及颜色的影响；b.影响被测金属离子的存在状态；c.影响络合物的组成；2.显色剂用量 吸光度A与显色剂用量cR的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。3.显色时间：实验确定 4.显色温度：实验确定 5.溶剂,10.4 吸光光度分析及误差控制,10.4.1 测定波
13、长的选择和标准曲线的制作 1.测定波长的选择 一般应该选择max为入射光波长。如果max处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。如图测定A，有B共存干扰，选500nm为测定波长，灵敏度虽有所下降，却消除了干扰，提高了测定的准确度和选择性。,测量波长的选择:“吸收最大，干扰最小”原则,2.标准曲线的制作（1）根据A=bc配制一系列不同浓度的标准溶液;（2）显色;（3）在选定的波长条件下;（4）选择合适的参比溶液;（5）测定吸光度，（6）以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，（7）绘制通过原点的标准曲线。,现象 标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当
14、溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯比耳定律的偏离。,引起偏离的因素（两大类）（1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；（2）化学性因素。,10.4.2 对朗伯-比尔定律的偏离,物理性因素：,1.非单色光引起的偏离 难以获得真正的纯单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯比耳定律的正或负偏离。,非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。,非单色光作为入射光引起的偏离：,假设由波长为1和2的两单色光组成的入射光通过浓度为c的溶液，则：A1lg（01/t1）1 bc A2lg(02/t2）2 bc故：,式中：01、02
15、分别为1、2 的入射光强度；t1、t2分别为1、2 的透射光强度；1、2分别为1、2的摩尔吸收系数；,A总=lg（0总/t总)=lg(I01+02)/(t1+t2）=lg(I01+o2)/(01 10-1bc+02 10-2bc）令：1-2=；设：01=02 A总=lg(2I01)/t1(1+10-bc）=A 1+lg2-lg(1+10-bc),因实际上只能测总吸光度A总，故,讨论：,A总=A1+lg2-lg(110bc)(1)=0；即：1=2=则：A总 lg（o/t）bc(2)0 若 0,lg(110-bc)值随c值增大而增大，则标准曲线偏离直线向c 轴弯曲，即负偏离；反之，则向A轴弯曲，即
16、正偏离。,讨论：,(3)很小时，即 1 2：可近似认为是单色光。在低浓度范围内，不发生偏离。若浓度较高，即使 很小，A总 1，且随着c值增大，A总 与A 1的差异愈大，表现为A-c曲线上部(高浓度区)弯曲愈严重。故朗伯-比耳定律只适用于稀溶液。(4)为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。,讨论：,选用谱带a的复合光进行测量，得到右图的工作曲线，A与c基本呈直线关系。选用谱带b的复合光进行测量，的变化较大，,则A随波长的变化较明显，得到的工作曲线明显偏离线性。,消除：（1）选择好的单色器；（2）选择max为测定波长；
17、（3）吸光度读数范围0.2-0.8,2.介质不均匀引起的偏离 避免产生胶体和沉淀：由于反射和散射，形成“假吸收”。,3.由溶液本身化学反应引起的偏离(化学性因素）a.解离 b.络合 c.缔合,朗伯比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；仅在稀溶液(c10-2 mol L-1时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液。溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时，使吸光质点的浓度发生变化。例：CrO42-+2H+=Cr2O72-+H2O 柠檬黄 橘黄,4.干扰及其消除方法 a.控制酸度 用磺基水杨酸测定Fe3+离子时,Cu2
18、+与试剂形成黄色络合物,干扰测定，但如控制pH在2.5左右，Cu2+则不与试剂反应。b.掩蔽 使干扰离子生成无色配合物或无色离子。c.改变干扰离子价态：d.选择合适的参比溶液 e.增加显色剂用量 f.分离,不同的透射比读数，产生的误差大小不同：lgT=bc微分：dlgT0.434dlnT=-0.434T-1 dT=b dc,两式相除得：,c/c不仅与仪器的透射比误差T 有关，而且与其透射比读数T 的值也有关。是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？,10.4.3 吸光度测量的误差,最佳读数范围与最佳值:,设：T=1%，c/c T 关系曲线T 在 15%65%之间时,浓度相对误差较小，最佳读数范围
19、:0.2-0.8,浓度相对误差最小时的透射比Tmin为：Tmin 36.8%,Amin 0.434,控制测量吸光度大小的方法：选择不同宽度的比色皿 改变测试溶液的浓度 改变入射光波长,10.5 其他吸光光度法,10.5.1.目视比色法（1）目视比色法（2）特点:不符合L-B定律 a.灵敏度高，可测 10-2-10-5,10-6-10-8 b.准确度高:RE=5-10%,光度法 2-5%c.应用广泛 d.仪器简单，操作简便、快捷。,采用标准溶液为参比溶液（浓度小于待测溶液）。设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs cx)。则：Ax=b cx As=b cs Ar=x s=b(cx cs
20、）=bc 绘制Ar c工作曲线，再根据cx=cs+c计算试样浓度。,10.5.2 示差吸光光度法-高含量组分的测定,示差法为什么能较准确地测定高浓度组分呢？,普通光度法:cs:Ts=10%，cx:Tx=5%，示差法:cs:Ts=100%，cx:Tr=50%，透射比读数标尺扩大了十倍。读数落入适宜读数范围内，提高了测量的准确度。,将不同波长的两束单色光(1、2)快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。=12nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。,10.5.3 双波长吸光光度法,1.单组分的测定 A-c 标准曲线法定量测定。,2.多组分的同时测定 根据吸光度的加合性求解联立
21、方程组得出各组分的含量。A=A1+A2+An,10.6 吸光光度法的应用,10.6.1 痕量金属的分析 根据待测金属离子，（1）选择适当的显色剂，（2）控制显色条件，（3）确定测定波长和恰当的测定条件，（4）利用标准曲线，对金属离子进行定量分析。10.6.2 临床分析（1）试样+载片(不同层有分析所需试剂)出现特征颜色。（2）半定量：试纸。10.6.3 食品分析 待测食品样品+生物试剂特征颜色，比色分析。,1.酸碱离解常数的测定,用于测定对光有吸收的弱酸（碱）的离解常数。HL=H+L-,(1)配制一系列总浓度(c)相等，而pH不同的HL溶液(2)测定各溶液的pH值。(3)在酸式(HL)或碱式(L-)最大吸收波长处，测吸光度。,10.6.4 其他应用:,根据分布系数的概念,(4)假设高酸度时，弱酸全部以酸式形式存在，则:AHL=HLc(5)在低酸度时，弱酸全部以碱式形式存在，则:AL=Lc,光度法测定一元弱酸离解常数的基本公式。,2.络合物组成的测定(1).饱和法（摩尔比法）M+nR=MRn 固定M，连续改变（增加）R，得一系列R/M值，测得相应的吸光度，作图。可得络合物的组成（摩尔比）。(2).连续变化法 改变 CM和CR,但使二者之和CM+CR=C，测得这一系列溶液的吸光度A，作图，即可由图获得络合物的组成。,
