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1、第七章 外源化学物致突变作用,第一节 概 述,一、基本概念,遗传 (inheritance)：生物物种在漫长的自然选择和生物进化过程中，以相对稳定的生命形式存在于自然界中，并能持续不断的繁衍后代，这个过程就是遗传。遗传是保持其种族特性的根本。这种长期保存遗传性状相对稳定的能力，与遗传物质DNA的特殊结构及其精确的复制与修复方式密不可分。,一、基本概念,变异 (variation)：遗传的稳定是相对的一方面生物的遗传物质在自我复制过程中可能发生改变；另一方面生物个体发育在受到复杂的内外环境条件影响下，性状的发育可能有所不同。于是在亲子之间或子代个体之间出现不同程度的差异，这种差异称为变异。变异是
2、生物物种推陈出新的来源。从现代基因论的观点出发，只有起源于基因和染色体的变异才能遗传。,突变 (mutation)：生物体遗传物质发生的突然的、根本的、可遗传的变化。因为这种变化起源于基因和染色体，所以突变实际上是遗传物质的一种可遗传的变异。,一、基本概念,致突变作用 (mutagenesis) ：外源因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且这种改变可随同细胞分裂过程而传递。简单的说 ，突变的发生及其过程即为致突变作用；突变 (mutation) 是致突变作用的后果。致突变物 (mutagen)：指能够引起突变的物质，又称诱变剂。,一、基本概念,致突变性 “ ” 遗传毒性,
3、致突变性（mutagenicity）：指引起遗传物质发生突变的能力，是精确的概念，在一个实验群体中突变率可定量检测。遗传毒性（genetic toxicity）：指对基因组的损害能力，包括对基因组的毒作用引起的致突变性以及其他各种不同效应。遗传毒性的概念广泛，包括致突变性，其效应可能转变固定为突变，也可能被修复。,遗传毒理学 (genetic toxicology)：主要研究化学性和放射性物质的致突变作用以及人类接触致突变物可能引起的健康损伤效应。遗传毒理学主要研究内容：致突变作用及机制； 应用检测系统发现和探究致突变物； 提出评价致突变物健康危害的方法。,一、基本概念,二、遗传学基础,1.
4、DNA与基因DNA：由脱氧核糖、磷酸及碱基组成，其基本成分为四种核苷酸，形成双螺旋结构，具有精确复制和高度保真特性，储存了所有的遗传信息。基因(gene)：是DNA分子中最小的完整功能单位。基本作用是决定蛋白质的一级结构，即每个基因决定一条多肽链或一种酶。基因是生物遗传信息的携带者。基因组(genome)：生物体的一套完整单体的遗传物质。,二、遗传学基础,2. 染色质与染色体在分裂间期细胞核中，光镜下可见一种能被碱性染料着色的物质，即染色质(chromatin)。染色质由DNA、蛋白、及少量的RNA组成，形似串珠状的复合体。在间期细胞核中，一般没有染色体结构，只有在细胞分裂时，染色质才螺旋化并
5、折叠成染色体(chromosome)，故染色质与染色体的物质组成是相同的。将体细胞的全部染色体按大小形态等方式排列起来即构成细胞的核型。每一个生物种属的核型是固定的。,二、遗传学基础,3. 体细胞和生殖细胞体细胞(somatic cell)：多数是二倍体(diploid)细胞，含有两组完全相同的染色体，其遗传损伤不会传递给下一代。生殖细胞(gemcell)：往往是单倍体，其染色体改变可以传给下一代。显性突变无论纯合子还是杂合子，均出现表型异常。隐性突变如为纯合子，将出现表型异常，如为杂合子，则为表型正常的携带者。,二、遗传学基础,4. 基因型与表型基因型：指控制生物性状的基因组成，是生物体遗传
6、性状发育的内因，是表型形成的根据。 表型：指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体表现。表型是不同基因之间以及基因与环境之间复杂的相互作用的结果。也就是说基因型决定表型可能发育的范围，会产生怎样的表型取决于生长发育所处的环境。环境因素对遗传所起的作用必须通过基因型才能实现，外界环境是基因型转变成具体表型的必要条件。,二、遗传学基础,5. 细胞周期、有丝分裂与减数分裂细胞周期：指细胞一次分裂结束后开始生长，到下一次分裂终末所经历的过程。细胞周期分为四个时期：G1期是细胞进行急剧合成的时期S期完成DNA复制G2期为有丝分裂做准备M期是有丝分裂期,有丝分裂(mitosis)：指细胞核分裂的过程，一
7、个细胞由此生成两个子细胞，每个子细胞具有与亲代细胞完全相同的染色体。有丝分裂中期染色体进一步浓缩成典型的形态，且分散排列在赤道面上，中期很适合做染色体的形态和结构方面的研究。 减数分裂(meiosis)：是一种特殊的有丝分裂，通过两个细胞周期，细胞核分裂两次，而染色体只复制一次，使染色体数目减少一半，成为单倍体。,二、遗传学基础,The course of mitosis,第二节 化学物致突变的类型,突变的分类,自发突变 (spontaneous mutation)是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。特点：自发突变的发生过程长，频率极低 , 与物种的进化有关。诱发突变 (i
8、nduced mutation)是指人为的造成突变 。它已被农、林、牧、渔业和园艺学家利用来培育和选择新种或良种。特点：发生过程短，频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害。,突变的分类,基因突变 (gene mutation)：一个或几个DNA 碱基对的改变。用光学显微镜观察不到，必须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断。染色体畸变 (chromosome aberration)：染色体的结构及数目改变，可用光学显微镜进行观察。染色体结构改变染色体数目改变,一、基因突变,基因突变：指基因中DNA序列的变化。因为基因突变限制在一个特定的部位，故称为点突变(point mutation)
9、。突变基因：存在突变的基因 野生型基因：没有发生突变的基因基因突变可分为两种类型：碱基置换(base substitution)移码突变 (frame shift mutation),一、基因突变,1.碱基置换(base substitution)某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。当DNA链上某一碱基由于致突变物作用而脱落或其配对性能发生改变，在DNA复制过程中该DNA互补链上的相应位点配上一个错误的碱基，即错误配对(mispairing)。这一错误配对的碱基在下一次DNA复制时，按正常规律配对，于是原来的碱基对被错误碱基对所置换，称碱基置换。,A,A,C,T,G,G,C,T,T,G,A,
10、C,C,G,A,A,C,T,G,G,C,T,T,G,A,T,C,G,T,T,G,A,C,C,G,A,A,C,T,G,G,C,A,A,C,T,G,G,C,T,T,G,A,C,C,G,T,T,G,A,T,C,G,A,A,C,T,A,G,C,A,A,C,T,G,G,C,T,T,G,A,C,C,G,T,T,G,A,C,C,G,A,A,C,T,G,G,C,Parental DNA,DNA replication,First generation progeny,3,5,5,3,Second generation progeny,Wild type,MUTANT,Wild type,Wild type,D
11、NA replication,Mismatch (about 1/1000 base additions),碱基置换的分类,转换(transition)：指原来的嘌呤被另一个嘌呤所取代或原来的嘧啶被另一个嘧啶所取代。颠换(transvertion)：指原来的嘌呤被另一个嘧啶所取代或原来的嘧啶被另一个嘌呤所取代。,碱基置换的后果, 同义突变：一个氨基酸可有26种密码子，当密码子的一个碱基被另一个碱基所取代时，密码子的意义恰恰没有改变，即同义突变。丝氨酸的密码子是UCU、UCC、UCA、CCG、AUG、AGC共有6种，由于碱基取代，使mRNA上的UCG转换成UCU、UCC、UCA，仍是其密码子。,
12、错义突变：密码子中某一碱基为另一碱基取代后，密码子的意义改变，成为另一种氨基酸的密码子。如AGU（丝氨酸）变成了GGU（甘氨酸），则mRNA指导合成的肽链中的丝氨酸变成了甘氨酸。致死突变：发生在必需基团上，严重影响蛋白质功能。渗漏突变：突变的产物仍有部分活性，表现型介于突变型与野生型之间。中性突变：突变不影响或基本不影响蛋白质的功能，性状改变不明显。, 无义突变：碱基取代的结果是使mRNA上的密码子转变成为终止密码UAA、UAG、UGA时，出现翻译过程停止，肽链延长提前结束。链终止突变：指无义突变使肽链过早终止。,终止密码突变：碱基取代的结果是使mRNA的终止密码转变成某种氨基酸的密码，则合成
13、的肽链将延长到出现下一个终止密码才结束。延长突变：指如果终止密码子因突变而为氨基酸编码，结果产生过长的肽链的现象。,2.移码突变 (frameshift mutation)发生一对或几对（3对除外）碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。由于碱基序列所形成的一系列三联体密码子相互间并无标点符号，于是从受损位点开始密码子的阅读框架完全改变。如果减少或增加的碱基对刚好是3对，则基因产物的肽链中仅减少或增加一个氨基酸，其后果与碱基置换相似，故不包括在移码突变范畴。,一、基因突变,移码突变的结果,错义突变：从原始损伤的密码子开始一直到信息末端的氨基酸
14、序列完全改变。无义突变：使读码框架改变其中某一点，形成无义密码 （UAA，UAG及UGA），不代表任何氨基酸，产生一个无功能的肽链片段。移码突变较易成为致死性突变。,二、染色体结构畸变,染色体结构畸变(chromosome aberration)：指染色体的结构改变，它是指遗传物质大的改变，一般可在细胞有丝分裂中期通过光学显微镜检查发现。染色单体型畸变(chromatid-typeaberration)：畸变涉及复制染色体中两条染色单体中的一条，损伤发生在DNA复制后；染色体型畸变(chromosome-typeaberration)：畸变涉及复制染色体中两条染色单体，损伤发生在DNA复制前。
15、,染色体结构异常是染色体或染色单体断裂所致。当断端不发生重接或虽重接而不在原处，即可出现染色体结构异常。,染色体结构异常的类型,缺失(deletion)：染色体上丢失了一个片段。重复(duplication)：在一套染色体里，一个染色体片段出现不止一次。倒位(inversion)：一个染色体片段被颠倒了，如颠倒的片段包括着丝点，称为臂间倒位(pericentdcimer-Sion)；如不包括着丝点则称为臂内倒位(paracentricinversion)。易位(translocation)：一个染色体片段的位置发生改变。最常见的是相互易位(recipromo），涉及两个非同源染色体片段的交换。
16、,三、染色体数目改变,非整倍体(aneuploidy)和多倍体(polyploidy)细胞的染色体数目不同于正常细胞染色体数目，称为基因组突变，即基因组中染色体数目改变。非整倍体：指增加或减少一条或几条染色体；多倍体：指染色体数目成倍增加。,第三节 化学物致突变作用 的机制及后果,一、引起突变的DNA变化,碱基损伤碱基错配平面大分子嵌入DNA链碱基类似物取代碱基的化学结构改变或破坏DNA链受损二聚体的形成DNA加合物形成DNA-蛋白质交联物,（一）碱基损伤,1. 碱基错配 指烷化剂提供甲基或乙基等烷基与DNA共价结合，所引起的甲基损伤表现为错配。一般情况下，发生频率：甲基化乙基化高碳烷基化目前
17、认为最常受到烷化的是：鸟嘌呤的N-7位，O-6位腺嘌呤的N-1， N-7位,烷化的碱基既可表现出像正常碱基一样的配对特性，也可有不同的配对特性，主要取决于烷化的位置。通常在鸟嘌呤7位氮(N-7)上的烷化有正常配对特性，而在鸟嘌呤6位氧(O-6)上的烷化易错配，引起G:C-A:T转换。,烷化剂不但可引起碱基错配，还可引起DNA二级结构改变。某些烷基(如鸟嘌呤N-7位上的烷基)，它是由许多烷化剂形成的主要加合物，造成碱基与脱氧核糖之间的连接键不稳定，使碱基丢失。丢失碱基的DNA留下了一个无嘌呤或无嘧啶的位点，通常称AP位点(apurinic or apyrimidinic site)。如果不正确的
18、碱基插入AP位点，可引起突变，且大部分是颠换。,（一）碱基损伤,2. 平面大分子嵌入DNA链嵌入剂以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻核苷酸链之间。吖啶分子多数是多环的平面结构，特别是三环结构，其长度是680nm，恰好是DNA单链相邻碱基距离的两倍。它能够结合到DNA分子上，插入相邻的碱基对，使它们分开，产生两个重组子，一个碱基对增多，一个碱基对减少，即造成碱基对的缺失或者额外碱基对的插入。通常引起移码突变。,（一）碱基损伤,3. 碱基类似物取代碱基类似物在DNA合成期即S期，与正常的碱基竞争，取代其位置。取代后会造成错误配对，即发生碱基置换。常见的例子是5-溴脱氧尿
19、嘧啶取代胸腺嘧啶，2-氨基嘌呤取代鸟嘌呤。,（一）碱基损伤,4. 碱基的化学结构改变或破坏有些化学物可对碱基产生氧化作用，改变或破坏碱基的结构，有时还可引起链断裂。它们主要改变核苷酸的化学组成。亚硝酸盐能使腺嘌呤和胞嘧啶发生氧化性脱氨，相应生成次黄嘌呤和尿嘧啶。甲醛可在体内形成有机过氧化物或自由基，间接使嘌呤的化学结构破坏，最终导致DNA链的断裂。,（二）DNA链受损,1. 二聚体的形成紫外线环丁烷嘧啶二聚体和(4-6)光产物(4-6-photoproduct) 阻止DNA的复制引起细胞死亡紫外线的致突变作用具有可逆性，表明突变作用不仅涉及碱基配对特异性的改变，而且还涉及与复制和修复有关的细胞
20、机制相互作用。,(二) DNA链受损,2.DNA加合物形成活性化学物质与细胞大分子之间通过共价键形成的稳定复合物。可引起碱基置换或移码突变。DNA加合物形成可活化癌基因，影响调节基因和抑癌基因的表达。生物毒素、多环芳烃和芳香氨类致癌物可使DNA形成大的加合物，DNA的立体构象发生明显变化，阻断受损部位的半保留复制和转录。,（二）DNA链受损,3. DNA-DNA交联(DNA-DNA crosslinks，DDC) DNA分子上一条链的碱基与互补链上的相应碱基形成共价连接，如亚硝酸、丝裂霉素C、芥子气以及各种铂的衍生物。,（二）DNA链受损,4. DNA-蛋白质交联物(DNA-protein c
21、rosslinks，DPC)许多化合物如烷化剂、苯并(a)芘、甲醛及一些重金属镍、铬等，均可引起DNA-蛋白质发生交联。虽然不同化学物引起DNA-蛋白质交联物的交联有所不同，但DPC一旦形成，必将对DNA构象与功能产生严重影响。与DNA交联的核蛋白作为维持DNA构象的重要成分，并参与DNA复制与转录的调控，因此DPC出现将造成基因突变。,二、引起突变的细胞分裂过程的改变,一些化学物能作用于纺锤体、中心粒或其他核内细胞器，从而干扰有丝分裂过程，使得染色体分离异常，产生非整倍体和多倍体。非整倍体与多倍体的产生机制相似，可能有程度上的不同，如干扰纺锤体形成，完全阻止形成多倍体，部分阻止形成非整倍体。
22、秋水仙碱是典型的引起细胞分裂完全抑制的物质，它能阻断微管蛋白的聚合，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使分裂间期和前期的细胞停滞在中期相，称为秋水仙碱效应。,三、DNA合成和修复有关的酶系统作用,DNA复制需多种酶类的参与，并且在基因调控下进行，这个过程中的任何一个环节损伤，将影响DNA复制的高保真性，有可能引起突变。修复DNA修复过程是清除受损伤的DNA片段，并合成新的片段来替换的过程。DNA是生命物质中唯一具有自身修复能力的分子，其修复过程是依赖各种各样的酶来进行。,四、突变的后果,突变的后果，取决于化学物所作用的靶细胞，生殖细胞，其影响有可能遗传到下一代。体细胞，其影响仅能体现在直接接触该物质的
23、个体，而不可能遗传到下一代。,生殖细胞突变的后果,致死性突变（影响后代数量）显性致死：突变配子与正常配子结合后，使精子不能受精，合子在着床前丢失或着床后早期胚胎死亡；隐性致死：需要纯合子或半合子才能出现死亡效应，杂合子则不出现死亡，可造成生育功能障碍。非致死性突变（影响后代质量）显性遗传：造成下一代遗传疾病发生率增加或新病种出现；隐性遗传：使得遗传易感性改变，增加下一代基因库的遗传负荷。,基因库（gene pool）：某一物种在特定时期中能将遗传信息传至下一代的处于生育年龄的群体所含有的基因总和。遗传负荷(genetic load)：指一种物种的群体中每一个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均
24、水平。,体细胞突变的后果,肿瘤：体细胞突变是细胞癌变的重要基础，许多肿瘤细胞中都可观察到癌基因的活化和抑癌基因的失活，并存在缺失、重复、易位、倒位等染色体畸变。致畸胎：致突变物可透过胎盘作用于胚胎体细胞引起畸胎，所以致畸作用不完全是亲代生殖细胞突变的后果。其他不良后果：动脉粥样硬化、衰老等。,第四节 机体对致突变作用的影响,遗传信息在所有物种中，均是世代相传，因为：DNA执行高保真度的半保留复制，对复制中的错误能及时纠正；机体可以修复DNA损伤，保护亲代DNA链免受化学物作用而发生改变。,机体修复DNA损伤的机制可分为两类,损伤耐受机制：指遗传可绕过那些阻止DNA复制的DNA损伤。如细菌的重组
25、修复机制是绕过不能配对的嘧啶二聚体或较大的化学加合物，在受损对应的新DNA链留下一间隙，然后通过重组过程，用来自母本链的DNA片段填补间隙。DNA修复机制：直接修复：指引起DNA损伤的反应为可逆性的，如光修复。切除修复：将损伤或不正确的甲基去除和替换，如核苷酸或碱基去除，它是负责较大范围损伤的修复。,一、直接修复,光复活“适应性”反应,光复活,紫外线损伤产生胸腺嘧啶二聚体，光复活依赖光裂合酶的作用，酶切下DNA上的嘧啶二聚体，将毗连的嘧啶接回原结构上，光裂合酶广泛存在于原核生物和真核生物体内。,光修复(light repairing),“适应性”反应,鸟嘌呤O-6位易被烷化，造成碱基错配，这时
26、可依赖烷基转移酶作用，将鸟嘌呤O-6位的甲基转给蛋白质O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基化转移酶（MGMT ），修复烷基化损伤，鸟嘌呤恢复正常的碱基配对特性。 MGMT广泛存在于酵母、大鼠及人类。,二、切除修复,核苷酸切除修复碱基切除修复错配修复,核苷酸切除修复,E.coli的切除修复机制,解螺旋酶,生物体内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。,碱基切除修复,DNA糖基化酶识别异常的碱基，切断碱基与脱氧核糖之间的键，使受损伤的碱基脱落，形成一个无嘌呤或无嘧啶的位点（AP位点）；AP内切酶将DNA链切断；插入酶将正确碱基插入AP位点；DNA聚合酶合成DNA片段，填补空缺；DNA连
27、接酶将新合成的互补片接上。与核苷酸切除修复相比，碱基切除修复的专一性更强。,错配修复,错配修复分识别、切除、修补等过程，是一类性质截然不同的切除修复。可以识别并除去错配的碱基对，该过程需要区分母链和子链，做到只切除子链上错误的核苷酸，而不会切除母链上本来就正常的核苷酸。,三、双链断裂修复,双链断裂修复依赖DNA蛋白激酶，通过填补损伤部位，使复制得以继续进行，但DNA损伤部位仍然存在。双链断裂修复与前述的修复交联不同，如切除修复可使DNA链结构部分或全部恢复原来的状态，而双链断裂修复达不到这种目的。严格来说，双链断裂修复不是修复，而是一种耐受过程，一种以容忍损伤继续存在和在高突变率情况下，换取细
28、胞继续生存的耐受过程。,四、交联修复,无误交联修复：降解双螺旋，使链内交联转变为链内二核苷酸加合物，接连于双链断裂处，随后Hollidy连接体分解，核苷酸切除修复最终去除二核苷酸交联。易误交联修复：其作用是次要的，指突变作为修复的结果或者作为损伤旁路发生的DNA修复，包括整个核苷酸切除修复和易误DNA聚合酶。,DNA损伤修复的一般特点,DNA损伤不仅可以因外源因素所致，也可以因内源因素所致；不同类型的DNA损伤通过不同的DNA修复途径修复；不同类型DNA损伤修复速度是不同的；DNA损伤修复机制有些是基本的，有些是可诱导的；DNA损伤修复功能存在物种和个体差异。,DNA损伤-修复-突变模式,致突
29、变作用是一个涉及多元因素相互作用的复杂细胞过程，它包括突变、修复和代谢。对于化学致突变作用的模式应为DNA损伤-修复-突变模式。任何DNA损伤，只要修复无误，突变就不会发生；如果修复错误或者未经修复，损伤就固定下来，于是发生突变。,二、遗传因素对致突变作用的影响,个体因素影响致突变作用有两个方面：先天因素：即遗传因素，也就是遗传多态性，是一个衡量遗传变异的数据，即群体中多态基因的比例。当一个基因座位的最常见的等位基因频率不超过0.99时，这个基因座位即是多态性。它在个体因素影响致突变作用中起决定作用。如代谢酶和修复酶的遗传多态性。后天因素：主要指不良的生活方式，如吸烟、饮酒、营养缺乏或不平衡等
30、。这些因素是产生突变的条件。,第五节 观察化学物致突变作用的基本方法,致突变试验的目的,检测外源性化学物的致突变性，预测其对动物和人类的致癌性；检测外源性化学物对动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人类的遗传危险性。,观察项目的选择,基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。但是还有许多试验所观察到的现象并不直接反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，仅反映致突变过程中发生的其他事件。将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(genetic mdpoint)。,致突变试验能反映的遗传学终点,1、基因突变2、染色体畸变3、染色体组畸变4、DN
31、A原始损伤,国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)于1983年提出致突变试验的遗传学终点可分为5类：DNA完整性的改变(形成加合物、断裂、交联)；DNA重排或交换；DNA碱基序列改变；染色体完整性改变；染色体分离改变。其中指基因突变，指染色体结构畸变， 指染色体数目改变。,致突变试验组合的原则,一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。如细菌回复突变试验、微核试验、染色体畸变分析和姐妹染色单体交换试验，这一组试验包括主要类型遗传学终点。体内试验与体外试验配合。一般体内试验和体外试验各有其优缺点，应取长补短，综合考虑。配套实验应包括多种进化程度不同的物种。如原核细胞、低等和高等真核
32、细胞，这样更加具有说服力。,二、常用的致突变试验,1. 细菌回复突变试验(Ames试验)细菌回复突变试验是利用突变体的测试菌株，观察受试物能否纠正或补偿突变体所携带的突变改变，从而判断其致突变性。其遗传学终点是基因突变。常用的菌株有鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimmIm)和大肠杆菌(E Coli)。,鼠伤寒沙门菌突变试验原理,鼠伤寒沙门氏菌的野生型菌株能自行合成组氨酸（his+），而人工诱变的突变株在组氨酸操纵子中有一个突变，这种组氨酸缺陷型突变菌株必需依赖外源性组氨酸才能生长，而在无组氨酸的选择性培养基上不能存活（his-）。致突变物可使其基因发生回复突变为野生型，使它在缺
33、乏组氨酸的培养基上也能生长。对于间接致突变物，可经代谢活化系统处理成为直接致突变物。,鼠伤寒沙门氏菌野生型(his+),组氨酸缺陷型突变株(his-),正向突变,回复突变,代谢活化系统,受试物,Ames试验标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变，TA100检测碱基置换突变，TA102对醛、过氧化物和DNA交联剂较敏感。这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，检测时提高试验敏感性。Ames试验的方法有平板掺入法，点试法及预培养法等。,结果判断,只要一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。仅四种菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。不加S9混合液得到阳性
34、结果，说明受试物是直接致突变物。加S9混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物。,2. 微核试验 (micronucleus test, MNT),微核(micronucleus)：指染色体或染色单体无着丝点断片，或因纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在子细胞的胞质中，单独形成一个或几个规则的次核，故称微核。在细胞质中微核来源有二：染色体断片或无着丝粒染色体，在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂物的作用使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。,微核试验(micronucleus test，MNT)：是用于染色体损伤和干扰细胞有
35、丝分裂的化学物的快速检测方法。 微核试验的灵敏度与细胞遗传学试验基本相同，能检测化学或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞（PCE）做微核试验。,为什么要选用PCE？,骨髓红细胞有丝分裂旺盛，造成一个较为灵敏的检测环境；嗜多染红细胞是红细胞成熟过程中的一个阶段，位于红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时，此时红细胞的主核已排出，微核容易辨认；嗜多染红细胞刚完成排核过程，从时间上可以控制了解微核率变化的全过程；嗜多染红细胞胞质含RNA，染色与成熟红细胞易于区别。,体外微核试验周围血微核试验双核细胞法免疫荧光染色法和荧光原位杂交法,改进的
36、微核试验,MN,NCE,试验步骤,健康成年ICR小鼠，实验前24小时予环磷酰胺40mg/kg腹腔注射染毒。小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打骨髓团块混匀。以 1000r/min速度离心 10 min，弃上清液，留下约0.5ml沉淀物混匀后，滴片两张，推片。将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15min，取出晾干。将固定晾干后的骨髓片，用Giemsa应用液染色1015min，轻微冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。显微镜观察并计数微核率。,PCE呈灰蓝色，成熟RBC呈粉红色，NC呈蓝紫色。PC
37、E中含有的微核大小为细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或椭圆形，边缘光滑整齐，染色性与细胞核一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可以出现一个或多个微核。每张片计数1000个PCE中含微核的PCE数。,3. 染色体畸变分析,染色体畸变分析(chromosome aberration analysis)：观察染色体形态结构和数目改变，又称细胞遗传学试验(cytogenetic assay)。染色体畸变只能在细胞分裂的中期相进行观察和分析。可观察到裂隙、断裂、断片、染色体环、双或多着丝粒染色体和染色体粉碎。为收集足够的中期相细胞，在收获细胞前，使用秋水仙碱处理，以阻断微管蛋白的聚合，抑制细胞分裂时纺锤
38、体的形成，使分裂间期和前期的细胞停留在中期相。细胞通过低渗处理，使染色体均匀散开，然后固定、染色，油镜下观察计数。,试验步骤,染毒：健康成年ICR小鼠，实验前24小时予环磷酰胺40mg/kg体重腹腔注射。收获细胞：处死动物前24h，秋水仙碱4mg/kg腹腔注射。小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸NS约5 ml插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，吸管吹打骨髓团块混匀，以1500 r/min离心10min，弃上清液。低渗：打散沉淀物，加入预温37的 0.075 mol/L KCl约6ml，混匀，于37低渗1520min，再加固定液 l2 ml混匀，立即以
39、1000r/min离心10min，弃上清液。,固定：重悬细胞，加入固定液4ml混匀，放置室温1020min，然后1000r/min离心10min，去上清液。同样方法再固定一次，弃上清液，留约0.5ml。制片染色：使细胞悬浮，用吸管吸取细胞悬液，距预冰冻的载波片1015Cm高处滴片，干燥，用10Giemesa染色液染色1020min，轻微冲洗，自然晾干。阅片计数。,染色体数目改变包括：整倍体变异：原先2n的染色体变为多倍体如3n或4n等。非整倍体变异：染色体组中的个别染色体增加或减少。染色体结构改变包括：裂隙(G)、断裂(B)、碎片(F)、环形(r)、交换(E)以及复合性断裂等。小鼠和大鼠的染色
40、体核型都为近端着丝点型。小鼠的染色体数为40条，大鼠的染色体数为42条。读片时每张标本片至少要分析100个中期分裂细胞。,4. 姐妹染色单体交换试验,姐妹染色单体：从DNA合成期染色体复制至有丝分裂后期中心粒分裂这段时间，由同一个中心粒连在一起的二条子染色体称为姐妹染色单体。姐妹染色单体交换(sister-chromatid exchange，SCE)：二条姐妹染色单体之间的物质交换就称为姐妹染色单体交换。即染色体同源座位上DNA复制产物的相互交换。如单体内DNA链受损，则可能通过这种交换方式进行重组修复。 因此SCE的出现常表明DNA曾经受损。,将 5-BrdU加入合成DNA的原料中，经过两
41、个分裂周期后，两条染色单体的其中一条双股DNA链内胸腺嘧啶核苷均被BrdU取代，另一条只有一股被取代。染色和光处理后，两条染色单体的着色深浅不同。如果两条染色单体间发生等位交换，可根据每条染色单体内出现深浅不同的染色片段，在光镜下进行识别，清晰分辨出交换的染色单体，计数SCE数，判断受试物对DNA是否有损伤作用。,姐妹染色单体交换试验原理,5. 程序外DNA合成试验,正常细胞需经过细胞周期达到增殖的目的，细胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，在S期的DNA合成是按固定程序进行的，称为程序性DNA合成(scheduled DNA synthesis)。当DNA损伤时，会发生在S期半保留DNA程
42、序合成之外的DNA合成，称之为程序外DNA合成(unscheduled DNA synthesis, UDS)。它是机体为保证遗传稳定性而对DNA双链上出现的变异或损伤进行修复合成的过程。,程序外DNA合成试验原理,程序外DNA合成试验是观察分离或培养的细胞，加入标记DNA合成原料，如3H-胸苷，在S期外是否有DNA合成发生，即是以3H-胸苷掺入细胞量的增加，判断受试物是否造成DNA损伤。,6. 单细胞凝胶电泳(SCGE)试验,单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)试验：在单细胞水平定量检测有核细胞DNA损伤与修复的方法。原理：将单细胞悬液
43、均匀混合在低熔点琼脂糖中，裂解液使细胞膜和核膜破裂，胞浆中的蛋白质等释放到裂解液中，只有DNA依然留在原位，强碱作用使DNA双链打开，并将其置于电场中泳动。若DNA发生断裂，则断裂的小片段DNA在电泳时泳动速度和大片段的DNA产生差异，出现如彗星一样的拖尾现象。通过检测拖尾率，DNA迁移距离等数据，可以观察到DNA损伤的程度。故又称为彗星试验（comet test)。,优点：此方法检测低水平DNA损伤的敏感性高，对样品的细胞数要求少，适应性高，操作简便，省时省力。缺点：有待于标准化，尚未被国际组织接受。,7. 观察方法的新进展,转基因小鼠致突变检测系统微核自动化检测技术荧光原位杂交技术,三、致
44、突变试验中的一些注意问题,1. 阴性和阳性对照的设立2. 体外试验的活化系统,3. 致突变试验与致癌试验的关系,化学物按遗传毒性和致癌性分类：遗传毒性致癌物，非遗传毒性致癌物，遗传毒性非致癌物和非遗传毒性非致癌物四类。致突变试验仅可检出遗传毒性致癌物和非遗传毒性非致癌物，有可能出现假阳性如遗传毒性非致癌物和假阴性如非遗传毒性致癌物。人类致癌物检测方法有三大类：短期试验，哺乳动物诱癌试验和人类流行病学观察。致突变试验是短期致癌物检测试验中的一大类，它需与其他试验结合，互为补充，以获得可靠的结论。,4. 试验结果在毒理学安全性评价中的作用,在评定结果之前，应首先检查实验的质量控制情况。致突变试验的
45、质量控制措施如下：设立阴性对照和阳性对照；盲法观察，指观察人员不了解观察标本的染毒剂量或组别，以免除观察人员对实验数据产生主观影响；资料的统计学分析，它是检验各处理组与对照组之间的差异，研究剂量-反应关系和定量强度；试验结果的重现性，即重复试验所得到的相同结果。重复试验指在不同时间完成的试验，而并非试验中的平行样本。,阳性结果判定条件具有剂量反应关系，即随着剂量的增加，致突变作用也增加；实验组观察值与阴性对照比较有显著性差异，即表明受试物具有致突变性。阴性结果判定条件最高剂量应包括受试物许可最大剂量或最大耐受量，常选LD50或LD80为最大剂量；各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学物。,
