第七章食品微生物检验大肠菌群粪大肠菌群大肠埃希氏菌计数ppt课件.ppt

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1、三、大肠菌群计数,（一）大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌1、大肠菌群在一定培养条件下(一般是3724小时)能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。（GB4789.32010） 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、枸橼酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。,2022/11/28,2,2、粪大肠菌群根据生长温度的差异，将能在37C生长的称为总大肠菌群，而在44.5C仍能生长的大

2、肠菌群称为耐热大肠菌群(thermo-tolerant coliform group) 或粪大肠菌群（faecal coliform Fc），在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群对粪便污染的指示作用更为直接和贴切，主要就是大肠艾希氏菌，但也包括克雷伯氏菌属，正是由于包括了克雷伯氏菌属，使其与粪便污染的相关性受到了影响。,3、大肠埃希氏菌（也称大肠杆菌）,分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。大肠艾希氏菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为+-或-+-的细菌。与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五

3、种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。,产气克雷白氏菌,大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染 。,大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。,总大肠菌群系指一群在37培养24小时能发酵乳糖、产酸产气、需氧和

4、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。,耐热大肠菌群即粪大肠菌群，作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。,致病性大肠杆菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞，具有痢疾杆菌样致病力。肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠毒素性大肠杆菌（ETEC）和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）等。,O157:H7（EHEC)肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。,4.大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系,5.

5、大肠艾希氏菌的生物学特性,（1）基本形态： 此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。,（2）培养特性：,A.大肠艾希氏菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37，在42-44 条件下仍能生长，生长温度范围15-46 。,B.在普通营养琼脂上有3中菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水

6、中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。,C.大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征：大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽.,6.大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠杆菌的卫生学意义1)大肠菌群和大肠艾希氏菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。第一，它可作为粪便污染食品的指示菌，第二，它可以作为肠道致病菌污染食品的指示菌。当食品中检出的大肠菌群数量多，肠道致病菌存在的可能性就愈大。 2)大肠菌群中包含的菌种可以在人、畜粪便中检出，而其检测方法简单，计数容易，菌群中包括的菌种类多，检出几率高，但有少数菌种可在营养丰

7、富的水体、土壤、腐败的植物等外环境中检出，即在非粪便污染的情况下，也有检出符合大肠菌群定义细菌的可能性，故在结果分析时应当慎重。而耐热大肠菌群的菌绝大多数均为埃希菌属的成员，更能表示样品被粪便污染的情况。,3)大肠艾希氏菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠艾希氏菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。 4)大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌这三个指标在实际工作中都在应用，但用途有所不同，一般认为大肠菌群是水源的卫生指标和食品加工卫生状况的通用指标，

8、粪大肠菌群主要用于贝类和贝类养殖用水的卫生指标，大肠杆菌用于指示食品受到近期粪便污染或不卫生加工。作为粪便污染的指示菌，大肠埃希菌检出的意义最大，其次是耐热大肠菌群，总大肠菌群的检出意义略差一些。 5)大肠菌群常用表示方法：最可能数-MPN（ mostprobablenumber） /100mL 。,1.大肠菌群计数方法类型A. MPN计数法（ 最可能数法 ） (GB4789.32010，GB/T 5750.122006)最常用的，适合于各类样品。B.平板计数法(GB 4789.32010)大肠菌群数量较多的样品可使用C.滤膜法(GBT 5750.122006)主要用于生活饮用水、瓶装水和其他

9、清亮液态样品。D.测试片法(纸片法)(GB l493494)常用于餐具大肠菌群检测。,（二）大肠菌群计数,2.食品微生物学检验 大肠菌群计数（ GB4789.32010 ）,第一法：大肠菌群MPN计数法第二法：大肠菌群平板计数法,3.MPN法原理,当欲对样品中某种细菌进行选择性计数时，由于样品中混有其他细菌，无法采用平板菌落计数的方法进行计数，在这种情况下可用MPN法计数菌数，特别是对菌数少的样品进行选择性计数很有用处，因为倾注平板法和表面涂布法计数的加样量分别为lml和0.1ml。最常用的MPN法是多管发酵法对水和食品中的大肠菌群的计数。该法还可用于计数粪大肠菌群、产气荚膜梭菌等。,最可能数

10、(most probable number，MPN)法是基于泊松分布的一种间接计数方法，又称为多管发酵法，是采用多次稀释直至无菌(multiple dilution to extinction)的方式进行。首先将被检样品尽量混合或研磨，使其中的细菌分布均匀，混合的样品通过系列稀释和等量分配为小样品，有些小样品最后含菌量极少，或不再含有待测的目的细菌；分别接种不同的小样于相应的培养管，培养后观察有无目的菌生长，查用概率计算方法制成的MPN检索表，推算原始样品中待测细菌的可能数。大肠菌群MPN法 是利用大肠菌群细菌能分解乳糖产酸产气的特性进行检测 即对未知样品做连续的10倍稀释，选择3个连续的10

11、倍稀释液，每种稀释液接种3管装有培养基的试管中培养，根据LST初发酵试验以及BGLB发酵证实实验，证实大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的最可能数。食品中大肠菌群数以每g（mL）样品中大肠菌群的最可能数来表示，即为大肠菌群MPN值。,4.仪器设备,除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱、恒温水浴箱、 均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。,5. 需要用到的培养基,（1）LST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨成分：胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCL 5.0g，乳糖5.0g，

12、K2HPO4 2.75g，KH2PO4 2.75g，月桂基硫酸钠0.1g，蒸馏水1000mL。 制法：将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm150mm试管中，每管10mL。121高压灭菌15min。最终pH6.80.2。,（2）BGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤成分：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，牛胆粉溶液200mL，0.1%煌绿水溶液13.3mL，蒸馏水800mL，pH7.20.1。制法：略,抑菌剂的选择,大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠

13、作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。,10-2,10-3,10-4,大肠菌群的检验程序,0,将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤,LST不产气（-）小导管里无气泡,LST产气（+）,1）样品的稀释（1）称取25g样品，放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min-10000r/min均质1min-2min ，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min ，制成1:10的样品匀液。（2）样品

14、匀液的pH值应在6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠NaOH或1mol/L盐酸HCl）调节。（3）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。,6.操作步骤,1）样品的稀释（ 1 ） 固体和半固体样品-称取25g 样品，放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 000r/min-10000r/min 均质1 min-2 min ，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水

15、的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。 （2） 液体样品以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。,6.操作步骤,（3） 样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。（4） 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1mL无菌

16、吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 （5） 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。,2）初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），361 培养24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复发酵试验。

17、未产气者为大肠菌群阴性。,LST结果判断,大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。,3）复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 1培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。,接种样本,大肠菌群MPN法测定的操作流程,根据大肠菌群阳性管数，检索MPN 表，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN 值。注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，表内的数也应相应减少或增加。 MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不

18、同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。,4） 大肠菌群最可能数（MPN ）的报告,表B.1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表,5）填写原始记录,6）MPN检索表的应用,（1）MPN（最可能数）是表示样品中活菌密度的估测。因此MPN值只是活菌密度的估算值，并不是样品中活菌数的真值。注1：本表采用3个稀释度0.1 g(mL)、0.01g(mL)和0.001 g(mL)，每个稀释度接种3 管。 注2：表内所列检样量如改用1 g（mL）、0.1g(mL)和0.01 g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01 g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)时，则表内数字

19、应相应增高10倍，其余类推。,（2）使用MPN检索表还应注意这个MPN检索表是ISO、FDA、AOAC、USDA/FSIS、北欧等标准通用的；表里的数字是有小数点的；报告单位不同。现报告单位为g/ml，而原报告单位是100g/ml；原标准MPN表有64个组合，而现标准MPN表只有40个组合；当实验结果在MPN表中无法查找到MPN值时，如：阳性管数为122，123，232，233等时，建议增加稀释度(可做45个稀释度)，使样品的最高稀释度能达到获得阴性终点，然后再遵循相关的规则进行查找，最终确定MPN值。,7）08和10版大肠菌群MPN计数较03版的优势有：,（1）名称更改，以大肠菌群计数代替原

20、来的大肠菌群测定。（2）增加了大肠菌群的平板计数法和纸片检测法（ 10版 删除了）。（3）大肠菌群的MPN法以乳糖为主改为以月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤为主的要培养基的MPN法。（4）大肠菌群的MPN法中原“报告每100 ml （或g）大肠菌群的MPN值”改为“报告每1 ml （或1g）大肠菌群的MPN值”。（5）08和10版操作更简单，适合批量检测；（6）08和10版检出的概率大 乳糖发酵培养基基本上不具备修复已损伤的细胞的作用，而月桂基硫酸盐胰蛋白胨则可以；（7）08和10版减少了人为的误差 03版需要挑选菌落，受人主观的影响很大，没有挑对或挑取的不够多都会导致假阴性结果，而08版采

21、取增菌液接种，会减少假阴性。,为规范食品中大肠菌群指标的检测工作，现公告如下： 现行食品标准中规定的大肠菌群指标以“MPN/100克或MPN/100毫升”为单位的，适用食品卫生微生物学检验大肠菌群测定（GB/T4789.3-2003）进行检测；以“MPN/克或MPN/毫升”、“CFU/克或CFU/毫升”为单位的，适用食品卫生微生物学检验大肠菌群计数（GB/T4789.3-2008）进行检测。 特此公告。 二九年十月二十六日,卫生部关于规范食品中大肠菌群指标的检测工作的公告(2009年第16号),03版大肠菌群MPN法测定的操作流程,8）注意事项,（1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实

22、实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37分解乳糖产酸产气”。 LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉汤允许“缓慢乳糖发酵（Slow lactose fermentations）”来促进菌体产气。BGLB中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。（2）初发酵阳性管，只能经过复发酵实验后，才有可能成为阳性。（3）在实际工作中，有时遇到初发酵时产酸，但导管内无气泡产生，复发酵却证实为大肠菌群阳性。有时导管内无气体，但在液面及管壁却可看到小气泡。（4） LST发酵管和BGL

23、B发酵管在灭菌以后要检查小导管内有无气泡,如果有气泡就不能再用了。（5）计算产气管的数量时以BGLB发酵管产气管的数量为准。,平板计数,证实试验,7.第二法 大肠菌群平板计数法,1）需要用到的培养基,VRBA：结晶紫中性红胆盐琼脂成分：蛋白胨7.0g，酵母膏3.0g，乳糖10.0g，氯化钠5.0g，胆盐或3号胆盐1.5g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g18g，蒸馏水1000mL，pH7.40.1,2)样品的稀释按第一法中的稀释方法进行。3)平板计数（1）选取2个3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1mL。同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。（

24、2）及时将15mL-20mL冷至46的结晶紫中性红胆盐琼脂VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL-4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于36l培养18h-24h。,（3）、平板菌落数的选择 选取菌落数在15-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm 或更大。,（4）证实试验 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，361培养24h-48h ，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。（5）大

25、肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105 CFU/g（mL）。,四、大肠埃希氏菌的计数GB/T4789.38 2012,1.参考标准和范围本标准采用的定义是大肠埃希氏菌，方法主要参考的是美国FDA Bacteriological Analytical Manual（2002）中的Enumeration of

26、 Escherichia coli and the Coliform Bacteria。本标准规定了食品中大肠埃希氏菌（Escherichia coli）计数的方法。本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不适用于贝类产品。,2 .国标定义,2.1 大肠埃希氏菌 Escherichia coli 大肠杆菌广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验为或的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。2.2大肠埃希氏菌的某些菌株对人有致病性。

27、相对于大肠菌群和粪大肠菌群，大肠埃希氏菌与粪便污染的相关性最好，应用也最悠久。自1892年被提议作为粪便污染的指示菌以来，已被应用了100多年。2.3方法大肠埃希氏菌MPN计数（第一法）大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）,3. 设备和材料,除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：361。3.2 冰箱：25。3.3 恒温水浴箱：44.50.2 。3.4 天平：感量为0.1g。3.5 均质器。3.6 振荡器。,3 设备和材料,3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL

28、。3.9 无菌培养皿：直径90mm。3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。3.11 菌落计数器。3.12 紫外灯：波长360nm366nm，功率6 W。,4 培养基和试剂,4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤。4.2 EC肉汤（E.coli broth）。 4.3 蛋白胨水。 4.4 缓冲葡萄糖蛋白胨水甲基红(MR)和V-P试验用 。4.5 西蒙氏柠檬酸盐培养基。4.6 磷酸盐缓冲液。,4 培养基和试剂,4.7 伊红美蓝（EMB）琼脂。 4.8 营养琼脂斜面。 4.9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）。 4.10 VRBA-MUG。 4.11 革兰氏染色液。 4.12 Kovacs

29、 靛基质试剂。 4.13 无菌1 mol/L NaOH。 4.14 无菌1 mol/L HCl。,大肠埃希氏菌MPN计数,初发酵,复发酵,伊红美蓝平板分离培养,营养琼脂斜面或平板培养,生化试验,5 操作步骤,5.1 样品的稀释5.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8 000 r/min10 000 r/min均质1min2 min，制成1:10 样品匀液。5.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。,5.1 样品的稀释,5.1

30、.3 样品匀液的pH值应在6.57.5之间，必要时分别用1 mol/LNaOH或1 mol/L HCl调节。5.1.4 用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1 mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。,5.1 样品的稀释,5.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。,5.2 初发酵试验,每个样品，选

31、择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1 mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36 1培养24 h2 h，观察小倒管内是否有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养48 h2 h。产气者进行复发酵试验。如所有LST肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果。,5.3 复发酵试验,用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于已提前预温至45 的EC肉汤管中，放入带盖的44.5 0.2 水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24 h2h。检查小倒管内是否有气

32、泡产生，如未有产气则继续培养至48 h2 h。记录在24 h和48 h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。,EC肉汤,EC肉汤主要成分： 乳糖、胆盐、胰蛋 白胨。大肠埃希氏菌因分 解乳糖而产气，使 小倒管中可见气泡。,5.4 伊红美蓝平板分离培养,轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板，36 1培养18 h24 h。观察平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。,EMB琼脂,主要成分：乳糖、营养物质。指示剂系统：伊红和美蓝。原理：大肠菌群分解乳糖产酸，使伊红与美蓝结合而形成黑色化合物，故菌

33、落呈黑紫色，并可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红、美蓝二者的比例有关。不发酵乳糖产酸的细菌，在碱性环境中不能使伊红、美蓝结合，因而形成无色的菌落。部分大肠菌群的菌株在EMB上可形成红色或粉红色的菌落。（应注意非典型的菌落）。,EMB琼脂上的大肠埃希氏菌,典型菌落：具黑色中心有光泽或无光泽的菌落。非典型的可疑菌落：粉红色，无黑心。,5.5 营养琼脂斜面或平板培养,从每个平板上挑5个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上36 1 ，培养18 h24 h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验,生化鉴定,取培养物进行靛基质试验、MRVP试验和柠

34、檬酸盐利用试验。大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别见表1。 表1大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌得生化鉴别,生化鉴定,注1：如出现表1以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。注2：生化试验也可以选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等方法，按照产品说明书进行操作,5.6大肠埃希氏菌MPN计数的报告,大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为或。只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN值。,5.7填写

35、原始记录,检样量的选择,注1：本表采用3个稀释度0.1 g(mL)、0.01g(mL)和0.001 g(mL)，每个稀释度接种3 管。注2：表内所列检样量如改用1 g（mL）、0.1g(mL)和0.01 g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01 g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。,6.大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）,6.1基本原理,4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷，英文缩写MUG。是一种不产生荧光的底物。由于96%的大肠埃希氏菌都具有葡萄糖醛苷酸酶，能分解-D葡萄糖醛苷，而使4-甲基伞形酮游离出来，在366 nm紫

36、外光下产生蓝色荧光。观察到蓝色荧光即可认为是大肠埃希氏菌阳性。MUG对大肠埃希氏菌的生长繁殖既没有抑制作用也没有促进作用，对菌落形态也没有影响。,大肠埃希氏菌VRB-MUG平板计数法,检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠杆菌ATCC25922）和产气肠杆菌（如ATCC13048）做阳性和阴性对照,6.2 操作步骤,6.2.1 样品的稀释，按5. 1进行。6.2.2 平板计数6.2.2.1 选取2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。,6.2 操作步骤,6.2.2.2 将10 mL15 mL冷至450.5的结晶紫中性

37、红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。6.2.2.2 待琼脂凝固后，再加3mL4 mL VRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36 1 培养18 h24 h。,6.2 操作步骤,检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠埃希氏菌ATCC25922）和产气肠杆菌（如ATCC 13048）做阳性和阴性对照。,6.3平板菌落数的选择,数在10 CFU100 CFU之间的平板，暗室360nm366nm 波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。,大肠埃希氏菌在VRBA上,大肠埃希氏菌在VRBA-MUG上,6.4 大肠埃希氏菌平板计数的报告,两个平板上发

38、荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g (mL)表示。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。,6.5VRBAMUG平板计数法的几点说明,MUG对大肠埃希氏菌的生长繁殖没有抑制作用也没有促进作用，对菌落形态也没有影响。经实验发现，在MUG浓度从0 g/mL到200 g/mL的范围内，大肠埃希氏菌生长繁殖率没有区别。MUG方法有大约4%的假阴性，特别是倍受关心的O157:H7菌株为阴性，令人感到遗憾，但经典的常规方法也同样存在这样的问题。常规方法不能检出不产气菌株和乳糖迟缓发酵菌株，而且由于O157:H7菌株不

39、能耐受44的培养温度而同样不能检出O157:H7菌株，普通变形杆菌等某些杂菌的存在对大肠埃希氏菌发酵乳糖的产气能力具有抑制作用，但对分解MUG产生荧光的能力没有抑制作用。,研究还证实，大肠埃希氏菌荧光反应比产气反应出现得更早，并且不受食品的影响，仅发现对牡蛎直接进行的检验不适合用MUG方法，因为牡蛎具有内源性葡萄糖苷酸酶。本标准采用的VRBA-MUG平板计数方法，正是以上述理论为依据，参照FDA方法而确立的，检验时间为18 h24 h，并能准确测出样品中大肠埃希氏菌的CFU数值，操作简便，但对于对染菌量低（如10 CFU/g）的样品不如MPN法适用。,五、粪大肠菌群计数GB4789.39-20

40、13,1、样品的稀释，按大肠菌群计数的进行。2、初发酵试验 对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。3、复发酵试验 用接种环将所有482h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.50.5水浴箱内,培养242h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。4、粪大肠菌群MPN计数的报告：按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值,六、常见食品卫生标准,酱油（G

41、B/T2717-2003）：细菌菌落总数： 30000 CFU/mL大肠菌群： 30MPN/100mL肠道致病菌： 不得检出巴氏杀菌乳（GB5408.1-1999）细菌菌落总数： 30000cfu/ml大肠菌群： 90MPN/100ml肠道致病菌： 不得检出,全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999） 特级 一级 二级细菌菌落总数：20000 30000 50000（cfu/ml）大肠菌群 40 90 90（MPN/100g）肠道致病菌： 不得检出 不得检出 不得检出,瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准(GB 17324-2003) 细菌菌落总数cfu/ml： 20大肠菌群MPN/100ml： 3致病菌(肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出,