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1、非结核分枝杆菌病的诊断与处理,背景,发达国家NTM病流行日渐突出,HIV/AIDS的流行使NTM疫情加剧,十九世纪八十年代 Robert Koch发现,NTM病四种主要表现,肺 病,淋巴结炎,皮肤骨关节病,全身播散,定义1、非结核分枝杆菌（NTM)：指结核分枝杆菌 菌群和麻风分枝杆菌以外的其它分枝杆菌。2、非结核分枝杆菌感染（infection of non- tuberculous mycobecterium）：感染 了NTM，但未发病。3、非结核分枝杆菌病（disease of non- tuberculous mycobecterium）：感染 了NTM，并引起相关组织、脏器的病变。,对
2、NTM分类的认识Runyon分类（1959年）特点：根据细菌的生物学特征区分。 与生长速度有关： 生长缓慢型和快速生长型 突出色素形成与否及形成的条件： 光产色、暗产色和不产色 以上述二点作为主要条件共分为I、 II、III、IV群。,群光产色菌，如堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌,群暗产色菌，如蟾蜍分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌,群不产色菌，如鸟分枝杆菌复合群（M.avium complex，MAC）、溃疡分枝杆菌,群快生长菌，如偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌,Runyon分类,对于临床医生价值有限微生物学家的分类方法 分枝杆菌微生物学方面的发展，包括快速培养技术、DNA探针、高效液体色谱分析方法
3、同一Runyon分类法下的分枝杆菌可以导致完全不同的临床疾病,流行病学 ,自然界普遍存在,尚未证实可以通过人传播,暴发流行 院内感染,流行具地理差异性,美国 MAC和堪萨斯,英国堪萨斯,日本 MAC和堪萨斯,中国快速生长危害很大,苏格兰玛尔摩,菌种致病性1、肺部病变 主菌种：鸟一胞内，堪萨斯，脓肿，蟾。 次菌种：猿，苏尔加，玛尔摩，偶然，龟2、淋巴结炎症 主菌种：鸟一胞内，瘰疬。 次菌种：偶然，龟，脓肿，堪萨斯。 3、皮肤病变 主菌种：海，偶然，龟，脓肿，溃疡。 次菌种：鸟一胞内，堪萨斯，土地， 耻垢，嗜血。,4、播散性病变主菌种：鸟一胞内，堪萨斯，龟，脓肿，嗜血。次菌种：偶然，蟾蜍。,5、其
4、它海分枝杆菌、偶然分枝杆菌和龟分枝杆菌还趋向侵犯医源性创伤部位，在院内感染中占有一席之地。,临床表现非结核分枝杆菌肺病为类似肺结核的慢性肺部疾病。常规X线发现的肺部少量病灶的无症状者， 及已有 空洞的突然咯血患者。发生于基础疾病之上，特别是慢性阻塞性肺 疾病（COPD）、支气管扩张,非结核分枝杆菌淋巴结炎多见于儿童颈淋巴结炎耳部、腹股沟、腋下淋巴结也可受累多为单侧无痛性粗糙的淋巴结肿大，常有窦 道形成。,非结核分枝杆菌皮肤病局部脓肿多由偶然、龟分枝杆菌引起海分枝杆菌可引起游泳池肉芽肿和类孢子丝菌病；溃疡分枝杆菌可引起Bairnsdale溃疡堪萨斯、苏尔加、嗜血分枝杆菌可引起皮肤播散性和多中心结
5、节病灶。,播散型非结核分枝杆菌病表现为播散性骨疾病、肝病、心内膜炎、心包炎及脑膜炎等。其他如鸟分枝杆菌复合群引起泌尿生殖系感染、偶然分枝杆菌引起眼部感染等。,NTM肺病的影像学表现,胸片:常见的是上叶尖后段浸润影、空洞或者多发结节 HRCT上直径小于10mm的多发小结节或多发性支气管扩张，还可见支气管小叶中央结节（即所谓的树芽征）薄壁空洞多见，周围肺实质浸润较少 较少发生支气管播散，一般为向周围肺组织直接播散 很少出现胸腔积液,56岁女性，反复咳嗽咳黄痰10年。2001年在我院痰培养鉴定为偶然分枝杆菌,非结核分枝杆菌病的诊治指南,美国胸科协会1997年,英国胸科协会1999年,我国中华医学会结
6、核病学分会2000年,诊断非结核分枝杆菌感染同时具备以下两项条件者可诊断为非结核分枝杆菌感染：(1)非结核分枝杆菌皮试阳性。(2)缺乏组织、器官受到非结核分枝杆菌侵犯的依据。,非结核分枝杆菌病可疑者重点是那些经正规抗结核治疗无效的结核病人。(1)痰涂片荧光染色发现大分枝杆菌形体；(2)标本分枝杆菌培养阳性，但其菌落状态和生长情况 与人型结核菌有异；(3)初治病人首次分离出的分枝杆菌对抗结核药物耐药；(4)痰中发现抗酸杆菌而临床表现与肺结核不相符者；(5)经支气管卫生净化处理后痰分枝杆菌不能阴转者；,(6)接受正规抗结核治疗的新发现肺结核病人 ， 疗程完成后仍反复排菌；(7)已诊断为肺结核的病人
7、应用各种抗结核药物 治疗无进步，痰菌仍呈阳性者；(8)有免疫缺陷，并已除外肺结核的肺疾患者；(9)医源性或非医源性软组织损伤或外科术后伤 口长期不愈者。 具备以上条件之一，即为非结核分枝杆菌病可疑者。,非结核分枝杆菌肺病具有呼吸系统和（或）全身性症状，经放射影像学检查发现有肺内病变，已排除其他疾病，在确保标本无外源性污染的前提下(1)痰NTM培养3次均为同一致病菌 (2)痰NTM培养2次均为同一致病菌，1次抗酸杆菌（AFB）涂 片阳性 (3)支气管灌洗液NTM培养1次阳性，阳性度2+以上 (4)支气管灌洗液NTM培养1次阳性，AFB涂片阳性度2+以上 (5)支气管肺组织活检物NTM培养阳性 (
8、6)肺活检见与NTM改变相似的肉芽肿，痰或支气管灌洗液 NTM培养阳性,肺外非结核分枝杆菌病(1)病变部位组织活检发现NTM 并显示分枝杆菌病的组织病理学特征；(2)病变部位组织活检未发现NTM， 但显示分枝杆菌病的组织病理学特征， 在排除其他疾病的基础上，结合临床 表现，谨慎作出诊断。,NTM的鉴定分型,染色特性、生长特征、微生物形态和生化反应 ：培养鉴定，操作繁杂、费时 BECTEC技术 DNA探针、PCR限制酶分析和基因序列分析： Hsp65基因、16S rRNA基因、DNAJ基因，IS6110和rpoB基因 高效液相色谱法和薄层层析,细菌菌种的快速鉴定,PCR DNA探针,PCR-RF
9、LP,PCR-测序,PCR,聚合酶链反应在体外合成基因序列,PCR-限制性内切酶片段多态性分析（PCR-RFLP法）,原理：不同分枝杆菌种间的差异,其本质是DNA水平上核苷酸序列存在差异。这种差异可影响限制性内切酶的切割位点,经限制性内切酶消化后,形成的DNA 片段数目、大小不同。凝胶电泳后分析指纹图谱的差异,可对分枝杆菌菌种进行鉴定,先用分支杆菌属特异性引物对标本DNA 进行扩增,其扩增产物再经RFLP 分析来鉴定菌种,用PCR-RFLP法鉴定脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌,细菌,抽提基因组DNA,PCR法扩增16s-23srDNA部分序列,脓肿,龟,Hae 酶切,Taq I酶切,230bp,23
10、0bp,200bp 30bp,110bp 120bp,230bp,Hae 酶切的电泳结果,M为DNA marker, 第1列为生化法初步鉴定为龟分枝杆菌的菌株(即上图中的第7列菌株），再经全套生化法鉴定实为偶然分枝杆菌，第2列为脓肿分枝杆菌标准株，其余为脓肿分枝杆菌临床株,Taq I酶切的电泳结果（一）,M为DNA marker。第1列为脓肿分枝杆菌标准株，其余为脓肿分枝杆菌临床株,Taq I酶切的电泳结果（二）,注：M为DNA marker。1、2列为经生化法鉴定为龟分枝杆菌的临床株，3、4列为龟分枝杆菌标准株，第5列为脓肿分枝杆菌标准株,PCR扩增细菌DNA的某个特异片段，直接测定DNA碱
11、基序列，分析分支杆菌种间序列差异,可达到分支杆菌菌种鉴定的目的DNA测序是检测DNA分子差异的最可靠方法,PCR-DNA测序,65000蛋白编码基因,rPOB 基因,16S-23SrDNA,DNA探针,DNA 探针是能识别特异核苷酸序列的带标记的一小段DNA分子,DNA杂交,DNA探针杂交简易图,DNA探针杂交简易图,正向杂交,反向杂交,待检DNA,DNA探针,DNA探针,待检DNA,正向杂交须先将PCR 产物固定,再与检测探针进行杂交,这样就要对每个标本的扩增产物进行固定,增加了操作步骤,反向杂交则预先将检测探针固定在尼龙膜上,再与变性的带有生物素标记的PCR 扩增产物。探针的固定在检测操作
12、前就可准备好, 从而使操作明显简便、省时,适于大样本的检测,16S-23SrDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针鉴定分枝杆菌菌种的研究,李国利,等. 中国防痨杂志, 2002.10,24(S1):12-14,分子生物学诊断的优点,快速：2-3天准确灵敏度高,检测成本较高；需要昂贵的仪器设备；可能有假阳性；操作复杂，要求高；,分子生物学诊断的缺点,治疗现状无特异高效的抗NTM药物抗结核药物仍在使用，但效果不佳NTM细胞表面的高疏水性及细胞壁 通透屏障： 是其广谱耐药的生理基础 是有效化疗的障碍,治疗进展1 疏水衍生物：利福布丁（Rifabutin,RFB） 等 破坏细胞壁：如乙胺丁醇(EMB) 克
13、服细胞壁通过障碍：如将抗结核药物加 入脂质体 多种机制不同的药物联用：如EMB、链霉 素（SM）、利福平（RFP）、环丙沙星 （CIP）等联用,治疗进展2新药研制利福类：RFB、利福喷丁(Rifapentin,RPE)、苯恶嗪利福 霉素1648(KRM1648)氟喹诺酮类（FQ）：司帕沙星(Sparfloxacin,SPFX)，莫 西沙星（Moxifloxacin)，乙胺沙星（Ct 934）新大环内脂类：克拉霉素（Clarithromycin, CTM）， 阿齐霉素 (Azithromycin,ATM)头霉素类：头孢西丁(Cefoxitin,CXT)，头孢美唑 (Cefmefazol,CMZ)
14、碳青霉烯类：亚胺培南(Imipenem,IPM)等噁唑烷酮类（oxazolidinone）：利奈唑胺（Linezolid）,治疗进展3老药新用磺胺类：磺胺甲恶唑（Sulfamethozole,SMZ） 复方磺胺甲恶唑（TMP/SMZ,SMZco）四环素类：强力霉素（doxycycline,DCC） 米诺环素（Minocycline,MOC）氨基糖苷类：妥布霉素(Tobramycin,TOB) 阿米卡星（Amikacin,AMK）,治疗注意：药物敏感试验，联合治疗，个体化方案，疗程1824个月，至少12个月。,鸟分枝杆菌复合群病包含ATM(500 mg，1次/d)或CTM(500 mg，2次/d
15、)在内的两种或两种以上药物EMB(15 mg.kg-1.d-1)可作为次选药物。第二、第三或第四线药物 ：氯法齐明（CLO，100 mg，1次/d），RFB(300600 mg），1次/d；也可使用利福喷汀RPT，环丙沙星(750 mg，2次/d)。 在某些情况下应用AMK (7.510 mg.kg-1.d-1) 应用异烟肼（INH）和吡嗪酰胺（PZA）无效 免疫机制正常者应该接受至少1824个月的治疗，AIDS患者须终身服药。,堪萨斯分枝杆菌（M.Kansasii）病INH(300 mg，1次/d)、RFP(600mg，1次/d)、EMB(15 mg/kg，1次/d) ，疗程18个月 对不能
16、耐受INH的患者，应用RFP和EMB治疗，最初3个月加或不加SM治疗 分离菌株对RFP耐药，可用 INH(900 mg，1次/d)加维生素B6（吡哆醇，500 mg/d）、EMB(25 mg.kg-1.d-1 ，和SM或AMK联用,快速生长分枝杆菌偶然分枝杆菌（M.fortuitum）病尚无理想方案，外科清除感染部位。可用AMK+CXT+丙磺舒26周，然后口服TMP/SMZ或DCC 26个月。建议试用新大环内酯类治疗。,龟分枝杆菌(M.chelonae)病：外科清除可能有助于CTM对皮下脓肿的治疗。应用CTM(500mg,口服,2/d) 6个月。脓肿分枝杆菌（M.abscessus）病必须包括
17、对感染伤口的外科清创术或异物切除；起始治疗可应用AMK合并CXT(12g/d)，以后可根据临床好转情况和药物敏感试验结果，改口服药；应考虑两药联合治疗，如CTM和FQ；严重病例的疗程应至少3月，骨骼感染至少6月。,其他非结核分枝杆菌病海分枝杆菌（M.Marinum）病 外科清创，微小损伤可单纯观察治疗方案：多西环素(100mg口服2/d)，SMZco（TMP160mg/SMZ800mg 2/d）；或RFP (600mg/d)加EMB(15mg/kg/d), 至少应用3个月。最近研究表明CTM(500mg/d)可能作为单药治疗有效。,瘰疬分枝杆菌（M.Scrofuaceum）病局部病变手术清除，
18、很少建议化疗方案未定，有用CTM加氯法齐明，伴或不伴EMB治疗。亦有用INH、RFP、SM加环丝氨酸（Cycloserine）治疗的报导。,溃疡分枝杆菌（M.ulcerans）病 RFP加AMK(7.5mg/kg 1/12h或2/d)或EMB加SMZco（TMP160mg/SMZ800mg口服，1/8h即3/ d）46周，手术清除。,展望 近十余年来对NTM病的研究已取得很大进展，但由于NTM数量多、分布广，且新的致病菌株不断出现，加之AIDS发病率和死亡率明显增高，使NTM病与结核病一样严重威胁人类健康。因此，在研究 NTM病迅速、准确的诊断方法的同时，研究可靠的药敏试验，高效的化疗药物和方案，以及有效的预防措施，已成为NTM研究的主要课题。,谢 谢！,
