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1、蛋白质的分离纯化与鉴定Isolation, Purification and Identification of Protein,分子生物学圣经分子克隆实验指南,为什么要纯化蛋白质？,理论意义：深入研究某种蛋白质的功能以及作用机制，如信号通路中的蛋白质应用价值-蛋白质工程 医药、工业、科研 作为药物靶点,蛋白质是生命功能的执行者,蛋白质工程中进行蛋白质纯化的必要性,首先，需要单一的蛋白质作为实验材料，研究其结构与功能；其次，对蛋白质进行修饰改造时需要单一的蛋白质作为原材料；最后，为了生产性能更优良的蛋白质，需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯化，从而开发出相关产品。,本章概要,蛋白质纯化方法蛋白
2、质纯化原则纯化步骤蛋白质的鉴定,一、蛋白纯化方法,蛋白质纯化的根据： 不同的蛋白质，理化性质不同。理化性质不同的原因： 氨基酸的数目和序列不同。,1.与蛋白质分离纯化相关的理化特性,分子大小分子形状带电特性溶解特性与配体特异性结合不同吸附性质变性和复性,1.1分子大小,蛋白质分子大小主要取决于： 蛋白质肽链的数目 每条肽链的氨基酸残基数目。几百百万 Da常用方法透析超滤凝胶过滤离心,透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一
3、定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,凝胶过滤,是按照天然蛋白质相对分子质量大小进行分离的技术，又称为分子筛层析或排阻层析。,超速离心,离心（centrifugation）：利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质分离开来的方法。,超速离心法 (ultracentrifugation)：60万 g ， 6万8万 r/min。可用来测定蛋白质分子量。,超速离心,1.2分子形状,形状蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受到分子形状的影响。方法梯度离心电泳,1.3电荷,原理蛋白质的净电荷与蛋白质等电点pI以及环境pH值有关（pHpI，）方法电泳
4、离子交换层析,1.4溶解度,原理蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，因此在溶剂中的溶解度不同。通过改变pH、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。方法：沉淀法盐析法（eg. 硫酸铵）有机溶剂沉淀法（eg. 丙酮）等电点沉淀法,蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，称为盐析。盐析原理：高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面的水化膜，影响蛋白质分子表面所带电荷，从而引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质的变性。,盐析法,1.5配体特异性结合,原理生物大分子的某些特定结构区域能够特异性识别其他分子并可逆结合，生物分子间的这种结合能力称为亲和力。方法将具有亲和力的两个分子中的一个固定在
5、不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。分类免疫亲和层析生物亲和层析金属螯合亲和层析,1.6吸附性质,原理 蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、陶瓷、塑料等。方法疏水层析,1.7变性和复性,原理变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性。复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能。方法如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中纯化原核表达蛋白,2. 分离方法,在实验操作上，分为：沉淀法离心法电泳法超滤法相分配法层析法,*不可能有一套统一的方法适用于分离纯化所有的蛋白质，*但每一种蛋白质可能都有一套适合的分离纯化程序，*
6、而且所用的主要技术手段都基本相同。,Note,二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤,总原则以合理的效率、速度、收率和纯度，将目标蛋白从细胞的全部其他成分，特别是从杂蛋白中分离出来，同时仍保留其生物学活性和化学完整性。,二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤,步骤选择实验材料，实验材料预处理蛋白质的提取蛋白质的粗分级蛋白质的细分级蛋白质的鉴定,蛋白质纯化的前期准备,关于蛋白质我们已知什么？最好的来源？蛋白质纯度要求？活性要求？纯化蛋白的量？如何进行鉴定？纯化时间长短？最终花费？纯化方案？,1、选择实验材料及预处理,选择实验材料物种的选择组织的选择实验材料预处理液体材料过滤离心固体材料洗涤：自来水蒸馏水提取
7、缓冲液材料破碎：,材料破碎,机械剪碎研磨反复冻融法超声破碎法高压匀浆法酶解法,2、蛋白质的提取,提取分离原则尽可能多地提取目的蛋白，同时避免活性丢失（温度过高、 pH、有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素）选择合适的pH、选择合适的离子强度,2、蛋白质的提取,提取液成分的确定pH 缓冲液：Tris-HCl, Tris-Gly, Gly-HCl, 柠檬酸-柠檬酸钠离子：动物 NaCl, 植物KCl还原剂:DTT蛋白酶抑制剂：EDTA, PMSF金属离子螯合剂: EDTA, EGTA去污剂:SDS, CHAPS, Triton X-100, Tween-20甘油温度 04,3、蛋白质的粗分级（粗提）,
8、使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质。常用的实验技术：沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）、超速离心、透析、超滤,4、蛋白质的细分级,粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化。常用的实验技术：层析,4.1. 层析（ chromatography ）,固定相：凝胶,流动相：缓冲液,原理：,凝胶介质,Pharmacia,BioGelA agaroseBioGel P acrylamide,Bio-Rad,Sephadex
9、glucose (dextrose)Sepharose agaroseSephacryl glucose + acrylamideSephacel cellulose,层析装置（Chromatographic equipment）,蠕动泵层析柱检测器记录仪部分收集器,4.1. 层析（ chromatography ）,分子筛层析（ Gel filtration ）离子交换层析（ Ion exchange ）疏水作用层析（ Hydrophobic interaction ）亲和层析（ Affinity ）,43,可编辑,4.1.1 分子筛层析 （Gel filtration）,原理也称为凝胶过滤
10、、排阻层析。是以多孔凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出，从而达到分离纯化的目的。凝胶介质葡聚糖 （glucose）琼脂糖 （agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）纤维素（cellulose）,分子筛层析Gel filtration chromatography,HydrophilicNo spontaneous binding to proteins.Chemically and physically stableRigid to allow a high linear flow-rate,亲水对蛋白质亲和力低物理化学性
11、质稳定流速稳定,分子筛层析Gel filtration chromatography,分子筛层析Gel filtration chromatography,分子筛层析Gel filtration chromatography,4.1.2 离子交换层析（ Ion exchange ）,原理在一定的pH条件下，不同的蛋白质带有的电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。利用蛋白质和带电凝胶之间作用力的差别，把蛋白质分开的层析方法。,4.1.2 离子交换层析（ Ion exchange ）,种类阳离子交换柱：凝胶带负电荷，蛋白质带正电荷阴离子交换柱：凝胶带正电荷，蛋白质带负
12、电荷介质惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖带电基团：羧甲基带负电；二乙基氨基带正电平衡离子： 负电基团：H+或Na+ 正电基团：OH-或Cl-,离子交换层析（ Ion exchange ）,阳离子交换：阴离子 先，阳离子 后阴离子交换：阳离子 先，阴离子 后,4.1.3 亲和层析（Affinity chromatography）,原理利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。将配体固定于支持物上，当混合样品流过此支持物时，只有目标蛋白能与配体专一性结合。先用缓冲液洗脱杂蛋白，然后改变洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。,亲和层析（Affinity chromatography）,Hi
13、s-亲合示意图（金属螯合层析）,固相载体,镍柱（Ni-NTA）,PET expression system,4.1.4 疏水作用层析,原理蛋白质表面疏水基团与介质疏水配体的可逆相互作用方法高离子强度下待分离的样品吸附在疏水介质上，然后降低离子强度选择性将样品解吸，疏水弱的物质先洗脱，疏水强的物质后洗脱。,4.2.电泳（ Electrophoresis ）,电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动。,蛋白质常用电泳技术,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等电聚焦电泳（ Isoelectric focusing- IEF）双向电泳（ Two
14、 Dimensional Electrophoresis ）,4.2.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS：1、覆盖蛋白质表面电荷，消除电荷差异2、改变蛋白质分子构象，消除形状差异,电泳法测目标蛋白的分子量,4.2.2不连续PAGE分离蛋白质的原理,在不连续电泳系统中，所带电荷、分子大小和形状不同的蛋白质在凝胶中能够被分离。原理电荷效应浓缩效应快慢离子效应凝胶浓度差效应分子筛效应,4.2.3 等电聚焦电泳（Isoelectric focusingIEF）,等电聚焦（Isoelectric focusing）,4.2.4 双向电泳,第一向：等电聚焦 （pI）第二向：SDS-PAGE (MW)双向
15、电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之一。,Isoelectric focusing,SDS gel electrophoresis,Two Dimensional Electrophoresis of E. coli Proteins,- more than 2,000 proteins were visualized,蛋白质纯化策略方案设计篇Protein purification strategy,三、纯化方案设计原则,确定纯化目标purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性to simplify techn
16、ique selection and optimisation确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 尽量减少纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically,确定纯化目标,三、纯化方案设计原则,确定目标purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性to simplify technique selection and optimisati
17、on确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 尽量减少纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically,三、纯化方案设计原则,确定目标purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性to simplify technique selection and optimisation确定活性测定方法fast detection of protein
18、activity/recovery and critical contaminants 尽量减少纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically,严格依据目标蛋白质的特殊生物学性质，来设计活性检测方案 常见检测方法:酶学检测 enzymatic assays.配体检测 ligand-binding assays免疫检测 immunological assays,活性测定方法的要求：快速、简便、特异和定量,确定活性检测方法,三、纯化方案设计原则,确定目标purity, activity and quan
19、tity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性to simplify technique selection and optimisation确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 尽量减少纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically,尽量减少纯化步骤,纯化步骤越多，样品损失越大（产量、活性）,减少每步操作时间to avoid lengthy procedures which risk
20、 losing activity/reducing recovery减少添加物additives may need to be removed in an extra purification step or may interfere with activity assays早期除去降解物（如蛋白酶）for example, proteases每步使用不同的纯化方法to take advantage of sample characteristics which can be used for separation (size, charge, hydrophobicity, ligand
21、specificity),KEEP IT SIMPLE!,尽量减少纯化步骤,四、蛋白质的鉴定,1. 浓度测定：凯氏定氮法、紫外吸收法2. 纯度测定：电泳法3. 特性测定：蛋白质分子质量与等电点的测定氨基酸组成及顺序分析蛋白质结晶与结构分析蛋白质活性及功能测定,1 浓度测定,凯氏定氮法紫外吸收法分光光度法考马斯亮蓝法,1 浓度测定,凯氏定氮法：蛋白质平均含氮量为16，首先测定氮的含量，进而估算蛋白质的含量。紫外吸收法芳香族氨基酸在280nm附近有最大光吸收。,1 浓度测定,分光光度法 蛋白质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定波长的光吸收与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量
22、。考马斯亮兰法等,2. 纯度鉴定,鉴定方法色谱纯：在层析图谱中只有一个洗脱峰电泳纯：在电泳图谱中只有一条电泳条带结晶纯：能够获得蛋白质晶体相互验证：在某一种鉴定方法下表现为均一的蛋白质在另一种方法可能表现为不均一，因此需要互相验证。,色谱纯,电泳纯,结晶纯,纯度实验反面例子：,杂峰,杂带,层析,电泳,3.蛋白质的特性测定,分子质量及等电点测定氨基酸组成及顺序分析结晶及结构分析免疫印迹（western-blotting）鉴定,3.1蛋白质分子质量及等电点的测定,分子质量SDS-PAGEPAGE等电点等电聚焦（IEF）,3.2氨基酸组成及序列分析,氨基酸组成水解蛋白质为氨基酸全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定序列分析质谱法推定法：从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列化学法水解法： Sanger法、Edman降解法、氨肽酶法 肼解法、羧肽酶法,3.4 免疫印迹鉴定,免疫印迹包括三个步骤凝胶电泳转膜抗原抗体显色反应,86,可编辑,
