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1、gP96多肽复合物树突状细胞疫苗的实验研究,gP96多肽复合物树突状细胞疫苗的实验研究,北京大学人民医院胸部微创中心胸外科,博士研究生： 李运导 师： 王俊 教授,研究背景,发病占全部肿瘤发生的15%，死亡占全部因肿瘤死亡病例的29%,整体疗效与30年前比较没有明显提高，总的五年生存率仍不足15%,肿瘤抗原,免疫系统,特异性抗原识别,破坏和消灭肿瘤细胞,抗原呈递系统,HSPs具有结合细胞内抗原性多肽的能力，可以带有肿瘤细胞内全部抗原肽-具有该细胞特有的抗原库的作用, 称为“分子伴侣”,抗原,gP96,经典的外源性抗原呈递途径,gP96介导的外源性抗原呈递途径,通过MHC-II类分子激活CD4+
2、T淋巴细胞,通过MHC-I类分子激活CD8+T淋巴细胞,途径,激发人体有效的特异性抗肿瘤免疫功能,树突状细胞-体内最强的抗原呈递细胞,+,gP96 or DC,科研工作新问题,单方面要素,两方面要素,gP96,多价性,特异性,（抗原库）,DC,识别抗原,激活细胞免疫,（专职抗原呈递细胞）,研究内容,肺癌组织提取gP96SDSPAGE凝胶电泳、银染鉴定、Western印迹分析 蛋白定量分析RT-PCR检测RNA水平表达免疫组化检测蛋白水平表达,第一部分 gp96多肽复合物提取鉴定 在肺癌组织中表达的研究,肺癌组织gP96提取和鉴定；肺癌组织和正常组织gP96的表达水平；,目的,流程,定量分析测得
3、所提取的gp96蛋白浓度在0.1g/ul左右，相当于50-80ug/g组织。,肺癌组织细胞浆中有棕黄色颗粒聚集,正常肺组织中细胞苏木素染色阴性,同一患者标本,外周血单个核细胞提取及体外扩增流式细胞仪鉴定gP96与树突状细胞共孵育制备疫苗体外CTL反应，INF-浓度淋巴细胞表型分析,第二部分 gP96多肽复合物/DC疫苗体外 诱导CTL反应实验研究,外周血来源DC培养和鉴定gP96多肽复合物/DC疫苗的制备gP96/DC体外实验,目的,流程,培养2-3天后的DC,培养7天后的DC,A-1培养前CD1a- A-2. 培养后CD1a+,B-1. 培养前CD86- B-2. 培养后CD86+,C-1.
4、 培养前CD83- C-2. 培养后CD83+,D-1. 培养前CD80- D-2. 培养后CD80+,E-1. 培养前CD14+ E-2. 培养后CD14-,CD14-；CD80+；CD83+；CD86+,培养前淋巴细胞的CD3 培养10d后淋巴细胞的CD3,培养前淋巴细胞的CD4、CD8 培养10d淋巴细胞的CD4、CD8,CD3/CD8T细胞明显增加；CD8/CD4细胞比例增加,建立动物模型以制备的疫苗免疫动物并种植肿瘤观察成瘤率，肿瘤体积，动物生存时间,第三部分 gP96多肽复合物/DC疫苗 动物体内实验研究,gP96/DC在小鼠体内的抑制肿瘤生长作用的研究,目的,流程,LA795肺癌
5、肿瘤组织,提取Gp96,小鼠外周血,615小鼠肺癌模型,Gp96/DC，Gp96，DC,提取DC细胞,观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响,SCID小鼠,PAa肺癌肿瘤组织,提取Gp96,人外周血,免疫重建小鼠,荷人肺癌免疫重建小鼠,Gp96/DC疫苗,提取DC细胞,观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响,100%,75%,615-LA795,：与组比较， P0.05。：与组和组比较，P0.05,：与组比较， P0.05。：与组和组比较，P0.05,SCID-PAa,：与组比较， P0.05。：与组和组比较，P0.05,87.5%,100%,讨 论,gP96在肺癌中的表达,基因表达的检测,mRN
6、A水平：原位杂交、Northern Blot、核酸酶保护分析 Real-time RT-PCR、半定量RT-PCR 。蛋白水平。,与正常组织相比，肺癌组织中编码gp96的基因在mRNA水平的表达明显增高的。这进一步证实了在罹患肿瘤时，以gp96为代表的HSPs合成明显增加，这是机体受到肿瘤刺激产生的热休克反应，以此来维持细胞内环境的稳定，是机体的一种保护性反应。,半定量RT-PCR法,mRNA水平,gP96,肺癌组织,正常肺组织,免疫组化法,蛋白水平,引物设计循环次数,操作中注意：,模板内对照,gP96的提取,提取gP96的经典方法（Srivastava）：,饱和硫酸铵沉淀,刀豆球蛋白A亲和层
7、析,DEAE离子交换层析,（提取率估计在20-30%，蛋白提取量在15-150ug/g组织 ）,存在的普遍问题：,蛋白提取率低 ，尚无法满足临床需要,解决：,更改其中的试剂或步骤：,去除饱和硫酸铵沉淀过程，离子交换层析柱换用MonoQ或POROS20QE柱,增加组织中gP96含量：,热刺激、缺氧等物理刺激或者通过转基因技术导入gP96cDNA重组真核表达质粒以增加细胞中gP96合成量,DC的来源,DC的分离和培养,密度梯度离心获取单个核细胞,富集前体DC,细胞因子体外扩增培养,DC的鉴定,关于动物肿瘤模型,分类,SCID小鼠,16号染色体近着丝点处单个隐性基因发生SCID突变,基因重排异常,免
8、疫球蛋白重链,T细胞抗原受体,T、B淋巴细胞前体分化,T、B淋巴细胞,细胞免疫,体液免疫,免疫球蛋白缺如,淋巴细胞严重减少,对体外移植物免疫排斥低,联合缺陷,+,1983年Bosma,免疫重建,1988年Moiser,骨髓,胸腺,脾,胎肝,外周血淋巴细胞,腹腔,皮下,免疫系统恢复且具有人类免疫系统的特征,与人体内环境极其类似保证了患者本身的安全,带有人类肿瘤具有人类免疫系统,研究肿瘤生长的理想动物模型,gP96/DC在体外可诱发强烈的CTL反应 在体内可有效抑制肿瘤生长,gP96+DC-特异性+多价性-避免了肿瘤的免疫逃逸,探寻机制,抗原肽（小分子）,DC,gP96+抗原肽,CD91,T淋巴细
9、胞,MHC分子、共刺激分子,粘附分子,体外扩增培养DC,未成熟DC,凋亡,gP96,成熟DC,直接与T淋巴细胞接触发生作用,未接触肿瘤抗原,不需激活,肿瘤抗原,非专职抗原呈递细胞,抗原特异性免疫耐受,专职抗原呈递细胞,特异性免疫防御反应,结 论,gP96/DC，在动物体内可降低肿瘤成瘤率，明显抑制肿瘤生长，延长宿主生存时间,属于个体化治疗方案，是未来原发肿瘤切除后微小转移灶的预防和治疗的有效措施之一,gP96在肺癌组织中RNA和蛋白水平的表达明显高于正常肺组织,gP96/DC疫苗在体外可激发更强烈的CTL反应，刺激T淋巴细胞增殖，CD8+/CD4+细胞比例增加，并使T淋巴细胞IFN-分泌明显增加,
