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1、MICA基因与结直肠癌遗传相关性免 疫治疗初探,导师 黄颖烽,学生 肖灿军,广州医学院附属市一院,2013年1月15日,研究的目的及意义立题依据研究的内容及指标技术路线主要技术关键及解决途径研究进度及预期达到的指标课题研究的支撑条件导师意见,研究目的及意义,MICA基因与上皮性恶性肿瘤存在免疫遗传相关,其基因多态性及基因频率在不同地区人群间的分布存在明显差异；从免疫遗传角度分析广东汉族人群中不同MICA基因分型与胃肠上皮性恶性肿瘤遗传相关性，探索建立具遗传背景的高危人群长期监控机制 MICA基因体内表达水平与上皮性恶性肿瘤病程转归密切相关；分析胃肠道肿瘤的发生发展及转归的过程中MICA基因表达
2、水平的动态变化，探索制定肿瘤极早期诊断的sMICA临界值，以期达到胃肠道恶性肿瘤早期诊断的目的 MICA基因表达影响体内多种免疫效应细胞功能表现，有利于表达NKG2D的免疫杀伤细胞发挥抗肿瘤作用。初步尝试建立带有MICA cDNA 的载体质粒表达分泌型MICA的细胞模型，模拟体内MICA-NKG2D反应机制，并尝试了解不同免疫药物对膜型/sMICA表达水平调控的影响，探索胃肠癌分子免疫治疗新思路。,立题依据,一 国内外研究现状,1、MIC基因研究现状 主要组织相容性复合体I类链相关蛋白A(Major Histocompatibility complex class I chain-relate
3、d protein A,MICA)是位于人类第六号染色体短臂6p21.31位置全长11,772bp，编码1382bp的转录子，含383个氨基酸残基 MIC基因家族又称PerB11, 它包括MICA、MICB、MICC、MICD、MICE、MICF和MICG七个成员，其中只有MICA、MICB具有编码、表达、转录蛋白的功能。 MICA基因具有高度的多态性，目前检测出约62个MICA等位基因， 分别命名为MICA001-053。MICA007包括00701-00703，MICA008为00801-00804, MICA002009012018各有两个等位基因。 不同种族、地区、人群中，MICA等位
4、基因存在遗传异质性，亚洲人群中常见MICA等位基因是MICA002、004、008、010、017MICA049 另外在MICA 外显子5微卫星(GCT)的重复数目发现了5个等位基因，分别命名为A4、A5、A5.1、A6、A9,广州地区汉族最常见的等位基因是A5,国内外研究现状,2 MICA的表达与肿瘤免疫治疗 肿瘤免疫学认为机体免疫系统和肿瘤细胞之间存在相互编辑作用，免疫系统重塑肿瘤细胞的免疫原性，肿瘤细胞改变免疫效应细胞的抗肿瘤效应（主要有NK、T细胞） MICA-NKG2D系统的肿瘤免疫治疗,NK细胞NKG2D受体与MICA的表达 NK细胞是机体内重要的淋巴细胞亚群，其表面存在识别肿瘤细
5、胞表面的活化和抑制性受体。NKG2D是介导NK细胞杀伤活性的主要活化性受体,T细胞表面受体与MICA的表达 CD8+ TCR和TCR均表达NKG2GD受体与靶细胞表面表达MICA配体结合充分活化T细胞，直接发挥杀伤功能，,MICA-NKG2D系统的肿瘤免疫治疗,正常情况下MICA蛋白仅微量表达于肠道上皮正常情况下当细胞受到感染、应激或恶性转化时可明显上调其表达量。现有对同属上皮源性肿瘤的其他肿瘤：如卵巢恶性肿瘤、肝肿瘤研究表明，MICA表达和肿瘤发展水平及浸润程度有一定的关联：早期肿瘤MICA表达量低，弥漫性肿瘤的表达量增高。Watson NF等人认为： MICA高表达患者的肿瘤预后及生存率均
6、高于MICA低表达或无表达患者MICA蛋白在体内存在膜型（mMICA）和可溶性（sMICA）两种形式,两者对机体免疫系统呈相反作用。sMICA 是由于肿瘤细胞的死亡，MICA分泌和金属蛋白酶水解，脱落到外周血的MICA，释放sMICA是肿瘤细胞削弱MICA-NKG2D系统监视的重要途径在MIC-NKG2D抗肿瘤机制中，Groh V, Li等人发现sMICA降低了肿瘤细胞MICA分子表达强度，而且能诱导T细胞表面和NK细胞表面受体NKG2D发生内化降解,导致CD8+T细胞和NK细胞NKG2D下调，抑制NK细胞杀伤活性，导致肿瘤逃逸。,研究的内容与指标,研究胃肠上皮性恶性肿瘤和MIC基因分型的免疫
7、遗传相关因素，广东汉族人群中不同MICA基因分型胃肠癌发病率的统计。包括：病人病情诊断；相应标本提取；病理活检确诊分期；病人及相应对照组MICA基因分型的确定.分析MICA基因及sMICA表达水平与各不同分期胃肠道恶性肿瘤病程转归之间的关系。.定性及定量分析sMICA并在病情发展过程中进行sMICA表达水平动态监测。针对性建立遗传背景的高危人群长期监控机制。建立长期回访机制，定期检测高危人群，达到极早期发现的、及早治疗的目的。确立胃肠癌分型分期的分子遗传学标准。结合sMICA动态检测结果及临床癌症转归，制定肿瘤早期确诊的sMIC临界值。（增加已有的消化道肿瘤癌标如CEA、CA199等进行对比分
8、析其作为癌标的价值及意义）初步探讨通过不同药物调控MICA-NKG2D机制进行肿瘤免疫治疗（文献报道干扰素可以上调肿瘤mMICA的表达、寻找另一种细胞因子对肿瘤mMICA表达的作用）MICA-NKG2D机制尚未明确、肿瘤的逃避机制尚未明确，机制的研究更具前瞻性,（红色表示我暂有的想法，需导师指点）,胃肠癌疑似病例,抽取外周血,内窥镜提取黏膜上皮组织,PCR-SSPMICA多态性基因分型,ELISA测定检测sMICA,XMAP定量检测sMIICA表达水平,病理切片确定分期,家族史,询问,相关遗传背景人群,抽取外周血,PCR-SSPMICA多态性基因分型,长期回访检测机制,技术路线,MICA基因表
9、达水平高低与胃肠癌发生、发展的遗传相关性正态回归分析,MICA-NKG2D系统在胃肠癌细胞模型中激活杀瘤机制初探,课题研究的进度及预期达到的指标,2013.03-2013.07 收集胃肠癌病人及相应对照组样本，进行MICA基因分型和sMICA定性定量分析,收集实验数据。 预期进展 估计收集分析样本50-100例，所得数据包临床病理免疫组化报告，相应标本MICA基因亚型及sMICA体内表达量实验室数据及其他消化道肿瘤相关癌标如CEA CA199等。2013.07-2013.08 收集实验所得数据，运用统计学软件进行所得数据统计回归分析整理写好文章。 预期进展 分析广东汉族人群MICA多态性基因频
10、率，总结广东汉族人中胃肠道癌症与MICA基因遗传相关因素及sMICA表达水平对癌症发生，病程转归及预后关系。2013.08-2013.12 继续相关实验 做好毕业论文及应对各种考试,主要技术关键及解决途径,1.研究标本取得及临床诊断 内窥镜获得胃肠道纤维上皮组织，送常规病理活检；病人及相关对照组外周血样本准备，送检。 2.MICA基因分型 提取全血基因组DNA, 采用PCR-SSP法(特异性引物-聚合酶链方法)扩增MICA基因特异性条带。实验结果经MICA基因分型基因微阵列比对，确定所属MICA多态性基因亚型。3.酶联免疫吸附(ELISA)反应定性测定血清中sMICA水平 采用MICA捕捉抗体
11、包被测试样品组及对照组血清sMICA表达水平 4.采用液相芯片技术（luminex XMAP）技术定量测定人血清MICA抗体 采用Luminex 技术通过对每份样品的底物荧光强度的测定来测定每份血清中的MICA抗体。荧光值大于等于3000则MICA为阳性反应。利用统计学的多元分析法进行分析MICA阳性的病人不同组间的相关性。找出MICA抗体阳性和病理活检之间的关系，分析MICA抗体表达水平与胃肠道肿瘤分期之间的关联。5、用SPSS11.5统计软件对实验数据进行统计学分析，数据以均数标准差（s）表示。胃肠癌患者组与健康对照组NK细胞NKG2D表达的比较采用成组设计的两样本均数比较的t检验；胃肠癌患者组与健康对照组血清sMICA水平的比较采用成组设计的两样本均数比较的t检验；不同病理分化程度的胃肠癌患者、不同TNM分期胃肠癌患者、不同转移程度胃肠癌患者NKG2D及sMICA表达水平的比较采用单因素方差分析,
