生物化学DNA生物合成课件.ppt

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1、核酸与蛋白质的生物 合成及基因工程,第一节 DNA的生物合成,一. DNA的半保留复制,Watson和Crick开创性的论文，对DNA双螺旋的描述以这样一段陈述结尾：“不出我们的意料，我们所假设的特异性配对立即提示一种遗传物质可能的复制机制。” 复制时, 每一条DNA链在新链合成中充当模板，按碱基配对方式形成两个新的DNA分子，每个分子都含有一条新链和一条旧链，这种复制方式即半保留复制(semiconservative replication)。,DNA复制可能的三种方式,新链,旧链,DNA的半保留复制的生物学意义：,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给

2、后代。 （但DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。）,DNA Replication,半保留复制,亲代,第一代,第二代,半保留复制的实验证据 1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA，首先证明了DNA的半保留复制。,由Meselson和Stahl设计证明半保留复制的实验被誉为 生物学最美丽的实验,Meselson和Stahl于42年以后在最初他们相遇的一颗树下重逢时的合影,Meselson 和Stahl的证明DNA半保留复制的实验流程,二. 复制的起点和方向,复制是一个高度协调的过程，母链解链和复制同时进行。（一）概念 复制子(replicon)：从一

3、个DNA复制起点开始，最终由这个起点起始的复制叉完成的片段。基因组能独立进行复制的单位。 起点(origin)：控制复制起始，是约含有100200个碱基对的一段DNA。细胞内存在着能识别起点的特殊蛋白质。,终点(terminus)：终止复制的序列位点.复制叉(replication fork)：复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构。,原核生物：只有一个复制子真核生物：多个复制子，多个起点，形成多个 “复制眼”或“复制泡”,（二）起始点和方向 1. 原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特定的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的保守顺序GATC和TT

4、ATCCACA，多次出现，可被酶识别。,2. 方向：大多是双向、对称复制, 也有单向或不对称的。 3. 速度： 原核生物复制叉移动快(约105bp/min); 真核生物复制叉移动慢 (约51025103bp/min),复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）,概述-DNA复制的一般特征,以原来的DNA两条链作为模板，4种dNTP为前体，需要Mg2模板DNA需要解链半保留复制需要引物主要是RNA，少数是蛋白质 复制的方向始终是53 具有固定的起点 多为双向复制，少数为单向复制 半不连续性 具有高度的忠实性,三. 原核细胞DNA的复制,（一）DNA聚合酶 ( DNA polymerase, DNA-

5、pol )DNA聚合酶是一种催化依赖模板的由脱氧核苷三磷酸前体合成DNA的酶。1956 年 Arthur kornberg 等首先从大肠杆菌中发现DNA聚合酶，其后在广泛不同的生物中都找到有这种酶。,以大肠杆菌为代表的 “-复制”系统为例,DNA聚合酶的反应特点： 4种dNTP底物：(dATP dGTP dCTP dTTP)； 接受模板指导: 解开成单链的DNA母链； 需引物提供3-OH； 新链生长方向： 53； 产物DNA性质与模板相同。,此外, DNA复制过程中还需其它酶和蛋白质因子.,* 引物 (primer) 是一个和模板链互补的线性片段, 其上带有能与核苷酸相结合的游离3-OH. 引

6、物通常是寡聚RNA.,1. 大肠杆菌DNA聚合酶 pol 也称Kornberg酶, 是各种DNA聚合酶中研究最透彻的，它的一些特点代表了DNA聚合酶的基本特点：（1） pol 的性质 分子量：103 000，单链，球形，活性部位含 Zn2， 电镜下可以看到二聚体，每个细胞有400个酶分子。,（2）功能： 53聚合酶活性； 酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正 确配对后才发挥聚合作用(对底物进行专一性核对) 3 5外切酶活性； 主要是对新生DNA链进行校对，防止“错配” 53外切酶活性。 主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物的切除及其空隙的填补 可见，DNA pol是1个多功能

7、酶。（DNA复制过程中碱基配对要受到双重核对）,2. 大肠杆菌DNA聚合酶 pol (1) 多亚基, 聚合酶亚基 (单链) 分子量为88 000, 每个细胞有100个酶分子（2）功能： 53聚合酶活性； 35外切酶活性。 （该酶无53外切酶活性 ） 目前认为该酶主要参与DNA损伤的修复。,3. 大肠杆菌DNA聚合酶 pol 真正的DNA复制酶，1972年发现 （1）pol 是真正起复制作用的酶，由10种亚基组成不对称二聚体, 、组成核心酶 （2）功能： 53聚合酶活性； 35外切酶活性。 该酶在原核细胞中主要负责DNA链的延伸，是复制延长中真正起催化作用的酶。 (该酶无53外切酶活性),E.

8、coli DNA 聚合酶不对称二聚体,可滑动的 夹持器亚基,催化亚基,35外切酶亚基,前导链 合成,后随链 合成,夹持器装置,催化亚基, 亚基保持核心酶 的二聚体结构,亚基具有53方向合成DNA的催化活性亚基具有35外切酶活性，起校对功能， 可提高聚合酶复制DNA的保真性 亚基可能起组建的作用亚基犹如夹子，功能是识别引物、夹住DNA 分子向前滑动 亚基起着促使核心酶二聚化的作用其余的亚基构成 -复合物，主要功能是帮助 亚基夹住DNA（也称夹子装置器），并有 增强核心酶活性的作用,DNA 聚合酶 pol pol pol 亚基数目 1 7 105 3 聚合酶活性 + + + 3 5 外切酶活性 +

9、 + +5 3 外切酶活性 + - -聚合速度(核苷酸/分) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000 持续合成能力 3-200 1 500 500 000功能 切除引物,修复 修复 复制,表 大肠杆菌3种DNA聚合酶性质比较,（1）DNA的半不连续复制： DNA双链复制时，一条链是连续合成的(前导链, leading strand), 另一条链是不连续合成的(滞后链或后随链, lagging strand), 这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制方式称DNA的半不连续复制。,（二）双链DNA复制的分子机制,1、冈崎片段和半不连续复制,（2）冈崎片段： 在不连续的后随

10、链DNA合成中形成的DNA短片段，在原核生物有10002000核苷酸，真核生物约100200核苷酸。1968年冈崎发现。,领头链(leading strand),后随链(lagging strand),DNA的半不连续复制,DNA的双向复制,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,2、DNA半不连续复制中的RNA引物 （1）前导链和滞后链的合成都需要RNA引物。 （2）引物合成酶(引发酶)：是以DNA为模板的RNA聚合酶（合成方向53）, 合成的引物长度为510多个核苷酸。 (3) 引物RNA的起始和终止的位置受解链酶、引发酶、模板顺序及其二级结构的影响。 （4）DNA聚合

11、酶切除前导链及冈崎片段的引物后, 填补空缺，由DNA连接酶将切口连接。,RNA引物的合成称作“引发” 。 后随链的合成需多次引发作用，而发动前导链的合成只需一次引发。 前导链的引物一般比冈崎片段的引物略长一些，前者大约为1060nt，后者通常为几个10多个nt。 成熟的DNA是不含RNA的，RNA引物最终被DNA所置换。,3、DNA连接酶（ligase）,催化两段DNA之间的连接:,3,5,5,3,5,3,5,3,HO,P,DNA ligase,NAD,ATP,NMN,AMP+PPi,+,DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口, 一端是3-OH, 另一端是5-磷酸基, 连接

12、酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 但它不能将两条游离的DNA单链连接起来。 大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶需要NAD+提供能量;在真核生物、病毒和噬菌体中，则要ATP提供能量。,4. 母本DNA双链的分离 (1) DNA解链酶(解螺旋酶)：通过水解ATP将复制叉前方的DNA双链打开。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。 (2) 单链结合蛋白(single-strand binding protein, SSB)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。 (3) DNA转轴酶（拓扑异构酶）和旋转酶（拓扑异构酶）: 兼有内切酶和连接酶活性, 可迅速使DNA两条链

13、断开又接上, 消除解链酶产生的拓扑张力。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量, 同复制有关。,总结: 原核生物DNA的复制过程:(以大肠杆菌为例) 双链的解开 起始-RNA引物的合成 DNA链的延伸 终止,B. RNA引物的合成 引发体先与DNA起始部位双链结合，通过引物合成酶形成前导链引物后，再沿53模板链与复制叉同向移动，在移动中断断续续形成冈崎片段的RNA引物。,A. 双链的解开 DNA旋转酶(拓扑异构酶)、 DNA解链酶、单链结合蛋白协同作用,C. DNA链的延伸 在DNA pol 的催化下，以四种dNTP为底物，在RNA引物的3 端以磷酸二酯键连接上脱氧核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链

14、的延伸同时进行领头链和后随链的合成。,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,前导链的延长： DNA pol 全酶二聚体的一个亚基与前导链的模板结合而发挥催化作用，与复制叉同向。,滞后链的延长: DNA pol 全酶二聚体的另一亚基与形成一个环的滞后链的模板结合发挥催化作用。 由于模板形成环, 酶向前移动时, 滞后链合成片段也沿53方向生长, 与酶催化方向一致。 滞后链片段合成接近前方滞后链片段5末端时, 模板被释放, 环消失。继续重复, 连续进行。, 当新形成的冈崎片段延长至一定长度, 其3-OH遇到上一个冈崎片段时即停止合成。 一旦冈崎

15、片段合成完成，其RNA引物即被除去，通过DNA聚合酶催化合成DNA取而代之，并形成一个切口，此切口由DNA连接酶连接封闭。,D. 复制终止 细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，在终止区相遇而停止复制，复制体解体。 这样, 以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的DNA互补链，结果形成了两个DNA双股螺旋分子。,就目前所知，起始阶段是DNA复制中唯一一个可以受调节的阶段，由于受到调节而使得DNA在一个细胞周期中只发生一次复制。,细菌复制终止区含有多个约22bp的终止子(terminator)位点，E. coli 有6个终止子位点。,大肠杆菌DNA复制终止区的结构,复制的保真性 ( fideli

16、ty )(忠实性)主要依赖 5 种机制：,5. DNA复制的高度忠实性,大肠杆菌DNA复制错配率约10-910-10。其染色体中有4.5106bp，平均每1 00010 000个细胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基。,（1）四种dNTPs浓度的平衡（2）DNA聚合酶的高度选择性（3）DNA聚合酶的自我校对(proofreading)（4）错配修复（5）使用RNA作为引物并最终被切除、置换,(一) 真核生物的DNA聚合酶:至少5种- ,DNA-pol 现认为其功能只是合成引物DNA-pol 在复制延长中起催化作用DNA-pol 校对、修复、填补(类似E.coli DNA pol I )DNA

17、-pol 线粒体DNA合成DNA-pol 核DNA修复,四、真核细胞DNA的复制（DNA指导 下的DNA合成）,推测在复制叉上有一个DNA pol, 以合成引物; 两个DNA pol, 分别合成前导链和滞后链。,（二）真核生物中DNA的复制特点,1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。2、冈崎片段长约200bp.3、真核生物DNA复制速度比原核慢。4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。5、真核生物有多种DNA聚合酶。6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体

18、间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5端RNA引物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。,五、反转录作用（RNA指导的DNA合成）,定义: 以RNA为模板, 按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA的过程称为反转录(reverse transcription, RT)。该过程由反转录酶催化进行。,1970年Temin和Baltimore同时分别从(鸡)劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出反转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有反转录酶。,病毒RNA的反转录过程 （以前病毒形式整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化） 单链病毒RNA RNA-DNA杂交分子 双链DNA（前病毒）,逆转录酶

19、是多功能酶，兼有3种酶的活性： RNA指导的DNA聚合酶活性 DNA指导的DNA聚合酶活性 核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子 中的RNA，可沿5 和3两个方向起核酸外切酶的 作用，切除杂交分子中的RNA,反转录酶也和DNA聚合酶一样, 沿53 方向合成 DNA, 并要求短链RNA作引物。,cDNA：利用反转录酶可合成出与任何RNA模板（mRNA，tRNA或rRNA）的碱基序列互补的DNA互补DNA（complementary DNA, cDNA）。 几乎所有真核生物mRNA分子的3 末端都有一段polyA, 当加入寡聚dT作为引物时，mRNA就可作为模板，在反转录酶催化下在体外合成与其互补的cDNA，为研究真核结构基因提供了有效途径。,反转录酶发现的理论和实践意义：不能把“中心法则”绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索，已经成为研究这些学科的有力工具。,