蛋白质组成成分和氨基酸课件.pptx

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1、第一节 蛋白质通论,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,Protein,第1页/共162页,一、蛋白质的功能多样性,1.催化功能 2.结构功能 3.运输功能 4.贮存功能 5.运动功能,6.防御功能 7.调节功能 8.信息传递功能 9.遗传调控功能 10.其它功能,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,第2页/共162页,二、蛋白质的分类,（一）按分子组成特点分类： 单纯蛋白质 结合蛋白质（二）按分子形状分类

2、： 球状蛋白质 纤维状蛋白质（三）按生物学功能分类：活性蛋白质 非活性蛋白质 （四）按溶解度分类： 可溶性蛋白质 醇溶性蛋白质 不溶性蛋白质,第3页/共162页,二、蛋白质的分类（一）按分子形状分类,1.球状蛋白 球形，多溶于水，多具有活性，长度与直径之比一般小于10。 如酶、转运蛋白、蛋白激素、抗体等。,2.纤维状蛋白 细长，分子量大，多是结构蛋白。 如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等。,第4页/共162页,二、蛋白质的分类（二）按分子组成分类,1.简单蛋白 由氨基酸组成7类：清蛋白球蛋白组蛋白精蛋白谷蛋白醇溶蛋白和硬蛋白。,2.结合蛋白 由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。7类：核蛋白脂蛋

3、白糖蛋白磷蛋白血红素蛋白黄素蛋白和金属蛋白。,第5页/共162页,三、蛋白质的元素组成与分子量,元素组成： 、含量 ： 克 6.25克 蛋白质每克样品中含N克数6.25100 =100克样品中蛋白质的含量（克%）,第6页/共162页,四、蛋白质的水解1、酸水解,第7页/共162页,四、蛋白质的水解 2、碱水解,第8页/共162页,四、蛋白质的水解 3、酶水解,第9页/共162页,第二节 氨基酸,一、氨基酸的结构与分类（一）基本氨基酸（二）不常见的蛋白质氨基酸 （三）氨基酸的生物学功能二、氨基酸的性质（一）物理性质 （二）化学性质,第10页/共162页,一、氨基酸的结构与分类,（一）基本氨基酸组

4、成蛋白质的氨基酸，20种。（二）稀有氨基酸是多肽合成后由基本氨基酸经酶促修饰而来。（三）氨基酸的生物学功能,第11页/共162页,（一）基本氨基酸,1、种氨基酸的化学名称及结构通式：,第12页/共162页,2、构型：从蛋白质水解得到的氨基酸属 L 氨基酸 COOH H2 N CH R代表氨基酸的侧链（基团）。 不同的氨基酸，基团不同。,第13页/共162页,氨基酸的分类,根据氨基酸的侧链R基团的化学结构分类：脂肪族氨基酸：甘、丙、缬、亮、异亮、 蛋、半胱、丝、苏、谷、 谷酰、天、天酰、赖、精芳香族氨基酸：苯丙、酪、色杂环氨基酸： 组、脯杂环亚氨基酸：脯,第14页/共162页,第15页/共162

5、页,第16页/共162页,第17页/共162页,第18页/共162页,第19页/共162页,氨基酸 基团 基团上有功能基团 丝Ser 羟基 半胱Cysh 巯基 天酰Asn 酰胺基谷酰Gln天冬Asp 羧基谷Glu 赖Lys 2氨基 精Arg 胍基 组His 咪唑基,第20页/共162页,极性氨基酸：极性不带电荷：甘、丝、苏、天酰、 谷酰、 酪、半胱 极性带负电荷：天、谷极性带正电荷：组、赖、精非极性氨基酸：丙、缬、亮、异亮、 苯丙、蛋、脯、色,根据氨基酸的侧链R基团的极性分类：,第21页/共162页,第22页/共162页,第23页/共162页,必需氨基酸： 机体维持正常代谢、生长所必需，而自身

6、不能合成，需从外界获取的氨基酸。如：Phe、Trp、Lys、Met、Leu、I1e、Thr、Val、His、Arg。非必需氨基酸： 体内能合成的氨基酸。12种,第24页/共162页,（二）不常见蛋白质氨基酸,第25页/共162页,第26页/共162页,r-氨基丁酸（GABA）,谷氨酸脱羧酶谷氨酸 r-氨基丁酸 2r-氨基丁酸的功能: 它是一种抑制性神经递质，对中枢神经原有普遍抑制作用，对突触前、突触后也有一定抑制作用。,第27页/共162页,（三）氨基酸的生物学功能,1、合成蛋白质，以满足机体生长发育和组织的更新修复等需要。2、转变成具有重要生理功能的含氮化合物（如核苷酸、尼克酰胺、儿茶酚胺类

7、激素、甲状腺素等）。3、转变成糖类或脂肪。4、氧化供能。,第28页/共162页,二、氨基酸的重要理化性质,（一）物理性质（二）化学性质,第29页/共162页,氨基酸的构型、旋光性和光吸收1、氨基酸的构型与旋光性Gly一种构型,无旋光性Thr和Ile有四种光学异构体。其余17种氨基酸有两种光学异构体：L型、D型。构成蛋白质的氨基酸均属L-型（L-苏氨酸）。,（一）物理性质,第30页/共162页,第31页/共162页,氨基酸的旋光性（符号和大小）取决于它的R基的性质，并与溶液的PH值有关。 外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。 L-苏氨酸和D-苏氨酸组成消旋物。,第32页/共162页,内消旋物

8、：分子内消旋胱氨酸有三种立体异构体：L-胱氨酸、D-胱氨酸、内消旋胱氨酸。L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物,第33页/共162页,2、氨基酸的光吸收性,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。 在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。 酪氨酸的max275nm，275=1.4x103; 苯丙氨酸的max257nm，257=2.0 x102; 色氨酸的max280nm，280=5.6x103;,第34页/共162页, 与苯异硫氰酸酯(PITC )的反应,COOH |+ H2N-CH | R,苯乙内酰硫脲氨基酸(PT

9、H-氨基酸) 无色,Edman反应,（二）化学性质,第35页/共162页, 与2,4-二硝基氟苯反应,COOH |+ H2N-CH | R,+HF,Sanger 反应,第36页/共162页,Sanger 反应2.4一二硝基氟苯（DNFB）DNP-氨基酸，黄色，层析法鉴定，被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸,第37页/共162页, 与茚三酮的反应,2,+,沸腾,蓝紫色化合物,第38页/共162页,第39页/共162页,成肽反应,R1 R2 H2NCHCOOH H2NCHCOOH,R1 R2 H2NCHCOHN CH COOH,二肽,第40页/共162页,两性解离和等电点,第41页/共1

10、62页,氨基酸的兼性离子形式,氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在。晶体熔点高离子晶格，不是分子晶格。 不溶于非极性溶剂极性分子介电常数高水溶液中的氨基酸是极性分子。,第42页/共162页,第43页/共162页,氨基酸的等电点,当溶液为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点（pI）。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。 不同的氨基酸，其等电点（pI）不同。,第44页/共162页,第45页/共162页,第46页/共162页,氨基酸的等电点,侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的p

11、K1和pK2的算术平均值： pI = (pK1 + pK2 )/2 对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pK2 )/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pK3 )/2,对于丙氨酸等一氨基一羧基的中性型氨基酸来说,由于羧基电离度略大于氨基电离度,所以溶于水时,其负离子数将多于正离子数,因而在纯水中显微酸性.,第47页/共162页,+2H,半胱氨酸,半胱氨酸,形成二硫键,第48页/共162页,第三节 肽,一、肽键及肽链二、肽的命名及结构三、天然存在的活性寡肽,第49页/共162页,蛋白质的基本结构单位是氨基酸，

12、由20 种氨基酸组成了各种各样的蛋白质。 研究证明，蛋白质是由许多氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键连接起来的生物大分子。,第50页/共162页,一、肽键及肽链,肽键（peptide bond）是蛋白质分子中氨基酸之间的主要连接方式，它是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基缩合脱水而形成的酰胺键。,第51页/共162页,R1 R2 H2NCHCOOH H2NCHCOOH,R1 R2 H2NCHCOHN CH COOH,二肽,第52页/共162页,一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基之间失去一分子水相互连接而成的化合物称为肽（peptide），由2 个氨基酸缩合形成的肽叫二肽（dipep

13、tide），由3 个氨基酸缩合形成的肽叫三肽（tripeptide），少于10 个氨基酸的肽称为寡肽（oligopeptide），由10个以上氨基酸形成的肽叫多肽（polypeptide）。,第53页/共162页,二、肽的命名及结构,肽链中的氨基酸由于参加肽键的形成已经不是原来完整的分子，因此称为氨基酸残基（amino acidresidues）。肽的命名是从肽链的N-末端开始，按照氨基酸残基的顺序而逐一命名。氨基酸残基用酰来称呼，称为某氨基酰某氨基酰某氨基酸。 例如，由丝氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸和亮氨酸组成的五肽就命名为丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸。,第54页/共162页,甘丙丝缬亮蛋

14、赖赖精谷 Gly-Ala-Ser-Val-Leu-Met-Lys-Lys-Arg-Glu G-A-S-V-L-M-K-K-R-E 在书写时，含自由氨基的一端总是写在左边，含自由羧基的一端总是写在右边。,第55页/共162页,多肽链 R1 R2 R3 H2NCHCOHN CH COHNCHCOOH,多肽链中单位氨基酸残基；多肽链有两端：氨基末端（端） 羧基末端（端）多肽链的主链：侧链：各基团,第56页/共162页,第57页/共162页,第58页/共162页,谷胱甘肽的结构： SH CH2 H2N-CH-CH2-CH2-CO-HN-CH-CO-HN-CH2-COOH COOH -2H 2 G-SH

15、 G-S-S-G （还原型） +2H （氧化型）,巯基,三、天然存在的活性寡肽,第59页/共162页,谷胱甘肽的功能,GSH可与氧化剂如H2O2起反应，从而保护一些含巯基的蛋白质或酶免遭氧化而丧失正常结构与功能。 如红细胞中的GSH可以保护细胞膜上含巯基的蛋白质和酶，以维护膜的完整性和酶活性。,第60页/共162页,谷胱甘肽的功能,H2O2,2H2O,2GSH,GSSG,NADP+,NADPH+H+,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,第61页/共162页,生物体中还有许多其它的多肽，也具有重要的生理意义。如牛加压素、催产素、舒缓激肽都是具有激素作用的多肽。,第62页/共162页,第四节 蛋白质的

16、分子结构,蛋白质的结构可以分为四个层次来研究，即一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。其中一级结构又称蛋白质的化学结构（chemical structure）、共价结构或初级结构。而二级结构、三级结构和四级结构又称为蛋白质的空间结构或三维结构(three dimensional structure)。,第63页/共162页,一、蛋白质的一级结构,1.蛋白质的一级结构 所谓蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序以及二硫键的位置。 一级结构是蛋白质分子结构的基础，它包含了决定蛋白质分子所有结构层次构象的全部信息。蛋白质一级结构研究的内容包括蛋白质的氨基酸组成、氨基酸排列顺序和二硫键的

17、位置，肽链数目，末端氨基酸的种类等。一级结构是蛋白质的肽键维系的。,第64页/共162页,第65页/共162页,第66页/共162页,2.蛋白质一级结构的测定 蛋白质一级结构的测定就是测定蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，这是揭示生命本质，阐明结构与功能的关系，研究酶的活性中心和酶蛋白高级结构的基础，也是基因表达、克隆和核酸顺序分析的重要内容。,第67页/共162页,蛋白质一级结构的测定主要包括以下基本步骤： 测定蛋白质的分子量和氨基酸组成 获取一定量纯的蛋白质样品，测定其分子量。将一部分样品完全水解，确定其氨基酸种类、数目和每种氨基酸的含量。,第68页/共162页,进行末端分析，确定蛋白质的肽

18、链数目及N-端和C-端氨基酸的种类 测定N-末端氨基酸的方法有多种，常用的有二硝基氟苯（DNFB）法和异硫氰酸苯酯（PTH）法（如氨基酸的化学性质中所介绍的）。还可以用丹磺酰氯（DNS-CL）法测定N-末端氨基酸。,第69页/共162页,测定C-末端氨基酸常用的方法有肼解法和还原法等。肼解法的原理为：多肽链和过量的无水肼在100反应510h，所有肽键被水解，除C-末端氨基酸自由存在外，其他氨基酸都转变为氨基酸酰肼。,第70页/共162页,拆开二硫键并分离出每条多肽链 拆开二硫键最常用的方法是用过甲酸（即过氧化氢甲酸）将二硫键氧化，或用过量的-巯基乙醇处理，将二硫键还原。还原法应注意用碘乙酸（烷

19、基化试剂）保护还原生成的半胱氨酸中的巯基，以防止二硫键的重新生成。,第71页/共162页,分析每条多肽链的N-末端和C-末端残基 取每条多肽链的部分样品进行N-末端和C-末端氨基酸的鉴定，以便建立两个重要的氨基酸顺序参考点。方法如前所述。,第72页/共162页,用两种不同方法将肽链专一性地水解成两套肽段并进行分离 将每条多肽链用两种不同方法进行部分水解，这是一级结构测定中的关键步骤。目前用于顺序分析的方法一次能测定的顺序都不太长，然而天然的蛋白质分子大多在100个残基以上，因此必须设法将多肽断裂成较小的肽段，以便测定每个肽段的氨基酸顺序。水解肽链的方法可采用酶法或化学法，通常是选择专一性很强的

20、蛋白酶来水解。,第73页/共162页,Trypsin ：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。,肽链,水解位点,胰蛋白酶,第74页/共162页,肽链,水解位点,糜蛋白酶,或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。,第75页/共162页,肽链,水解位点,胃蛋白酶,Pepsin：R1和R2R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸，水解速度较快。,第76页/共162页,肽链,水解位点,thermolysin)：R2=苯丙氨酸Ph

21、e,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸，水解速度较快。,嗜热菌蛋白酶,第77页/共162页,肽链,水解位点,羧肽酶和氨肽酶,分别从肽链羧基端和氨基端水解。,第78页/共162页,测定各个肽段的氨基酸排列顺序并拼凑出完整肽链的氨基酸排列顺序 多肽链部分水解后分离得到的各个肽段需进行氨基酸排列顺序的测定，序列测定可用氨基酸序列分析仪。然后用重叠顺序法将两种水解方法得到的两套肽段的氨基酸顺序进行比较分析，根据交叉重叠部分的顺序推导出完整肽链的氨基酸顺序。,第79页/共162页,比如有一蛋白质肽链的一个片段为十肽，用两种方法水解，水解法A

22、 得到四个小肽，分别为Al：Ala-Phe；A2：Gly-Lys-Asn-Tyr；A3：Arg-Tyr；A4：His-Val。水解法B 得到三个小肽，分别为B1：Ala-Phe-Gly-Lys；B2：Asn-Tyr-Arg；B3：Tyr-His-Val。将两套肽段进行比较分析得出如下结果：,第80页/共162页,二硫键位置的确定 根据已知氨基酸顺序选择合适的专一性蛋白水解酶，在不打开二硫键的情况下部分水解蛋白质，将水解得到的肽段进行分离。将分离得到的含有二硫键的肽段进行氧化或还原，切断二硫键。分离切断二硫键以后生成的两个肽段，并确定这两个肽段的氨基酸顺序。将这两个肽段的氨基酸顺序与多肽链的氨基

23、酸顺序比较，即可推断出二硫键的位置。,第81页/共162页,第82页/共162页,二、蛋白质的二级结构,蛋白质的二级结构（secondary structure）是指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕的方式。研究证明，蛋白质的二级结构主要有-螺旋、-折叠和转角。氢键是稳定二级结构的主要作用力。,第83页/共162页,(一)肽单位的构象 肽单位（peptide group）是多肽链中从一个-碳原子到相邻-碳原子之间的结构。,第84页/共162页,第85页/共162页,肽单位的构象具有三个显著的特征：1肽单位是一个刚性的平面结构 肽键中羰基碳原子与氮原子之间所形成的键不能自由旋转，因为这个键（C-N 键

24、）的长度为0.132nm，比一般的C-N 单键（0.147nm）要短些，而比一般的C=N 双键（0.127nm）要长些，所以具有部分双键的性质，不能自由旋转，这样使得肽单位所包含的六个原子处于同一个平面上，这个平面又称为酰胺平面或肽平面。,第86页/共162页,2肽平面中羰基氧与亚氨基氢几乎总是处于相反的位置 由于连接在相邻两个-碳上的侧链基团之间的立体干扰不利于顺式构象的形成，而有利于伸展的反式构象的形成，所以蛋白质中几乎所有的肽单位都是反式构象.,第87页/共162页,3C和亚氨基N 及C与羰基C 之间的键是单键，可以自由旋转 -碳原子与羰基碳原子之间的键是一个纯粹的单键，-碳原子与亚氨基

25、氮原子之间的键也是一个纯粹的单键，因此，可以自由旋转。C-N 键旋转的角度通常用表示；C-C 键旋转的角度用表示，它们被称为C原子的二面角或肽单位二面角.,第88页/共162页,第89页/共162页,(二)蛋白质的二级结构 1951 年，Pauling 和Corey 根据对一些简单化合物（如氨基酸和寡肽）的X-射线晶体图的数据，提出了两个周期性的多肽结构模型，分别称为-螺旋结构和-折叠结构。,第90页/共162页,1-螺旋(-helix)结构-螺旋结构具有以下主要特征：（1）-螺旋结构是一个类似棒状的结构，从外观看，紧密卷曲的多肽链主链构成了螺旋棒的中心部分，所有氨基酸残基的R 侧链伸向螺旋的

26、外侧，这样可以减少立体障碍。肽链围绕其长轴盘绕成右手螺旋体。,第91页/共162页,（2）-螺旋每圈包含3.6 个氨基酸残基，螺距为0.54nm，即螺旋每上升一圈相当于向上平移0.54nm。相邻两个氨基酸残基之间的轴心距为0.15nm，每个残基绕轴旋转100。,第92页/共162页,（3）-螺旋结构的稳定主要靠链内的氢键维持。螺旋中每个氨基酸残基的羰基氧与它后面第4 个氨基酸残基的-氨基氮上的氢之间形成氢键，所有氢键与长轴几乎平行。螺旋内的一个氢键对结构的稳定性的作用并不大，但-螺旋内的许多氢键的总体效应却能稳定螺旋的构象。实际上，-螺旋结构是最稳定的二级结构。,第93页/共162页,第94页

27、/共162页,第95页/共162页,2-折叠结构 又称为-折叠片层（-plated sheet）结构和-结构等。这是Pauling 和Corey 继发现-螺旋结构后在同年又发现的另一种蛋白质二级结构。-折叠结构是一种肽链相当伸展的结构，多肽链呈扇面状折叠。,第96页/共162页,-折叠结构的特点如下：（1）在-折叠结构中，多肽链几乎是完全伸展的。相邻的两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm。侧链R 交替地分布在片层的上方和下方，以避免相邻侧链R 之间的空间障碍。,第97页/共162页,（2）在-折叠结构中，相邻肽链主链上的C=O 与N-H 之间形成氢键，氢键与肽链的长轴近于垂直。所有的肽键都参与

28、了链间氢键的形成，因此维持了-折叠结构的稳定。,第98页/共162页,（3）相邻肽链的走向可以是平行和反平行两种。在平行的-折叠结构中，相邻肽链的走向相同，氢键不平行。在反平行的-折叠结构中，相邻肽链的走向相反，但氢键近于平行。从能量角度考虑，反平行式更为稳定。,第99页/共162页,3-转角结构 -转角结构（-turn）又称为-弯曲、-回折、发夹结构和U型转折等。蛋白质分子多肽链在形成空间构象的时候，经常会出现180的回折（转折），回折处的结构就称为-转角结构，一般由四个连续的氨基酸组成。,第100页/共162页,第101页/共162页,三、超二级结构和结构域,（一）超二级结构 蛋白质分子中

29、的多肽链在三维折叠中形成有规则二级结构聚集体，如-螺旋聚集体（型）、-折叠聚集体（型）以及-螺旋和-折叠的聚集体，常见的是型聚集体。在球状蛋白质中常见的是两个聚集体连在一起，形成结构，称为Rossmann 卷曲。这种由二级结构间组合的结构层次称为超二级结构。超二级结构一般以一个整体参与三维折叠，作为三级结构的构件。,第102页/共162页,（二）结构域 结构域（structural domain）是介于二级和三级结构之间的另一种结构层次。所谓结构域是指蛋白质亚基结构中明显分开的紧密球状结构区域，又称为辖区。多肽链首先是在某些区域相邻的氨基酸残基形成有规则的二级结构，然后，又由相邻的二级结构片段

30、集装在一起形成超二级结构，在此基础上多肽链折叠成近似于球状的三级结构。,第103页/共162页,四、蛋白质的三级结构,（一）蛋白质的三级结构及其特点 蛋白质的三级结构（tertiary structure）是指多肽链在二级结构、超二级结构以及结构域的基础上，进一步卷曲折叠形成复杂的球状分子结构。三级结构包括多肽链中一切原子的空间排列方式。维持这种特定构象稳定的作用力主要是次级键，它们使多肽链在二级结构的基础上形成更复杂的构象。肽链中的二硫键可以使远离的两个肽段连在一起，所以对三级结构的稳定也起到重要作用。,第104页/共162页,第105页/共162页,蛋白质的三级结构有以下共同特点：（1）具

31、备三级结构的蛋白质一般都是球蛋白，都有近似球状或椭球状的外形，而且整个分子排列紧密，内部有时只能容纳几个水分子。,第106页/共162页,（2）大多数疏水性氨基酸侧链都埋藏在分子内部，它们相互作用形成一个致密的疏水核，这对稳定蛋白质的构象有十分重要的作用，而且这些疏水区域常常是蛋白质分子的功能部位或活性中心。,第107页/共162页,（3）大多数亲水性氨基酸侧链都分布在分子的表面，它们与水接触并强烈水化，形成亲水的分子外壳，从而使球蛋白分子可溶于水。,第108页/共162页,（二）维持蛋白质构象的作用力 蛋白质的构象包括从二级结构到四级结构的所有高级结构，其稳定性主要依赖于大量的非共价键，又称

32、次级键，其中包括氢键、离子键、疏水键和范德华力。此外，二硫键也在维持蛋白质空间构象的稳定中起重要作用。主要的次级键有以下几种：,第109页/共162页,1氢键 由一个极性很强的XH 基上的氢原子与另一个电负性强的原子Y（如O、N、F 等）相互作用形成的一种吸引力，本质上仍属于弱的静电吸引作用。氢键是保持肽链折叠结构的主要因素。,第110页/共162页,2离子键 带相反电荷的基团之间的静电引力，也称为静电键或盐键。蛋白质的多肽链由各种氨基酸组成，有些氨基酸残基带正电，如赖氨酸和精氨酸，有些氨基酸残基带负电，如谷氨酸和天冬氨酸。带相反电荷的基团，如羧基和氨基、胍基、咪唑基等基团之间都可以形成离子键

33、。,第111页/共162页,3疏水键 蛋白质分子含有许多非极性侧链和一些极性很小的基团，这些非极性基团避开水相互相聚集在一起而形成的作用力称为疏水键（hydrophobic bond），也称疏水作用力。这种疏水相互作用在维持蛋白质的三级结构中也起到重要作用。,第112页/共162页,4范德华力 范德华力（Vander Waals interactions）是一种非特异性引力，任何两个相距0.30.4nm的原子之间都存在范德华力，范德华力比离子键弱，但在生物体系中却是非常重要的。,第113页/共162页,第114页/共162页,五、蛋白质的四级结构,具有独立三级结构的多肽链彼此通过非共价键相互连

34、接而形成的聚合体结构就是蛋白质的四级结构（quaternary structure）。在具有四级结构的蛋白质中，每一个具有独立的三级结构的多肽链称为该蛋白质的亚单位或亚基（subunit）。亚基之间通过其表面的次级键连接在一起，形成完整的寡聚蛋白质分子。,第115页/共162页,第116页/共162页,第117页/共162页,第五节 蛋白质结构与功能的关系,蛋白质的种类很多，各种蛋白质都有其独特的生物学功能，而实现其生物功能的基础就是蛋白质分子所具有的结构，其中包括一级结构和空间结构，从根本上来说取决于它的一级结构。,第118页/共162页,一、蛋白质一级结构与功能的关系（一）分子病与结构的关

35、系 分子病是指蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序与正常顺序有所不同的遗传病，如镰刀型贫血病就是一例。,第119页/共162页,镰刀形红细胞贫血症血红蛋白遗传信息的异常,HbA：正常成人HbHbs：镰刀形红细胞贫血症Hb,第120页/共162页,（二）同功能蛋白质中氨基酸顺序的种属差异 有些蛋白质存在于不同的生物体中，但具有相同的生物学功能，这些蛋白质被称为同功能蛋白质或同源蛋白质。研究发现，不同种属的同一种蛋白质其一级结构上有些变化，这就是所谓的种属差异。,第121页/共162页,（三）一级结构的局部断裂与蛋白质的激活 生物体中的很多酶、蛋白激素、凝血因子等蛋白质都具有重要的生物学功能，但它们

36、在体内往往以无活性的前体（precursor）形式贮存着，酶的无活性的前体称为酶原。这些酶原在体内被切去一个或几个段肽后才能被激活成有催化活性的酶。,第122页/共162页,二、蛋白质的空间结构与功能的关系（一）核糖核酸酶的变性与复性,第123页/共162页,蛋白质的变性是可逆的，同时也说明，蛋白质分子多肽链的氨基酸排列顺序包含了自动形成正确的空间构象所需要的全部信息，蛋白质的特定的空间结构是其特有的生物功能的基础。,第124页/共162页,（二）蛋白质的变构现象 一些蛋白质由于受某些因素的影响，其一级结构不变而空间结构发生变化，导致其生物功能的改变，称为蛋白质的变构现象或别构现象。变构现象是

37、蛋白质表现其生物功能的一种普遍而十分重要的现象，也是调节蛋白质生物功能的极为有效的方式。,第125页/共162页,第126页/共162页,NH3 + Pr COOH,NH3+ Pr COO-,NH3 Pr COO-,OH-,OH-,H+,H+,阳离子,阴离子,兼性离子,（pHPI） （pH=PI） （pHPI）,一、蛋白质的两性性质和等电点,第六节 蛋白质的重要性质,第127页/共162页,溶液中蛋白质的带电状况与其所处环境的pH 有关。当溶液在某一特定的pH 条件下，蛋白质分子所带的正电荷数与负电荷数相等，即净电荷为零，此时蛋白质分子在电场中不移动，这时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点，此时

38、蛋白质的溶解度最小。由于不同蛋白质的氨基酸组成不同，所以都有其特定的等电点，在同一pH 条件下所带净电荷不同。,第128页/共162页,带电质点在电场中向相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳（electrophoresis）。由于蛋白质在溶液中解离成带电的颗粒，因此可以在电场中移动，移动的方向和速度取决于所带净电荷的正负性和所带电荷的多少以及分子颗粒的大小和形状。由于各种蛋白质的等电点不同，所以在同一pH 溶液中带电荷不同，在电场中移动的方向和速度也各不相同，根据此原理就可利用电泳的方法将混合的各种蛋白质分离开。,第129页/共162页,二、蛋白质的胶体性质 蛋白质是生物大分子，蛋白质溶液是稳

39、定的胶体溶液，具有胶体溶液的特征，其中电泳现象和不能透过半透膜对蛋白质的分离纯化都是非常有用的。蛋白质之所以能以稳定的胶体存在主要是由于：,第130页/共162页,（1）蛋白质分子大小已达到胶体质点范围（颗粒直径在1100nm 之间），具有较大表面积。（2）蛋白质分子表面有许多极性基团，这些基团与水有高度亲和性，很容易吸附水分子。（3）蛋白质分子在非等电状态时带有同性电荷，即在酸性溶液中带有正电荷，在碱性溶液中带有负电荷。由于同性电荷互相排斥，所以使蛋白质颗粒互相排斥，不会聚集沉淀。,第131页/共162页,NH3 + Pr COOH,NH3+ Pr COO-,NH3 Pr COO-,OH-,

40、OH-,H+,H+,阳离子,阴离子,兼性离子,（pHPI） （pH=PI） （pHPI）,第132页/共162页,三、蛋白质的变性与复性 蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用。变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。,第133页/共162页,引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。不同

41、蛋白质对各种因素的敏感程度不同。,第134页/共162页,蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失（二）某些理化性质的改变（三）生物化学性质的改变,第135页/共162页,如果变性条件剧烈持久，蛋白质的变性是不可逆的。如果变性条件不剧烈，这种变性作用是可逆的，说明蛋白质分子内部结构的变化不大。这时，如果除去变性因素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性（renaturation）。,第136页/共162页,四、蛋白质的颜色反应 蛋白质分子中的肽键、苯环、酚以及分子中的某些氨基酸可与某些试剂产生颜色反应，这些颜色反应可应用于蛋

42、白质的分析工作，定性定量地测定蛋白质。,第137页/共162页,（一）双缩脲反应 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到180，2 分子尿素缩合成1 分子双缩脲并放出1 分子氨：,第138页/共162页,双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应（biuret reaction）。蛋白质分子中含有许多肽键，结构与双缩脲相似，因此也能产生双缩脲反应，所以可用此反应来定性定量地测定蛋白质。凡含有两个或两个以上肽键结构的化合物都可有双缩脲反应。,第139页/共162页,（二）蛋白质黄色反应 蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱，颜色加

43、深呈橙黄色。这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。,第140页/共162页,第141页/共162页,第八节 蛋白质的分离纯化及鉴定,一、蛋白质分离纯化的一般原则 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在04的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。,第142页/共162页,二、分离纯化蛋白质的一般程序分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处

44、理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：,第143页/共162页,1. 机械破碎法2. 渗透破碎法3. 反复冻融法4. 超声波法5. 酶法,第144页/共162页,(二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。,第145页/共162页,（三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。常用的有下列几种方法：,第146页/共162页,1.

45、透析 将蛋白质溶液(不纯)放入透析袋中，放在流水中（纯水），让低分子杂质（如盐类）透过半透膜扩散入水内，蛋白质则留在袋中，分离纯化蛋白质。,第147页/共162页,半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。,第148页/共162页,2. 利用分离蛋白质的沉淀作用 蛋白质的沉淀作用是指在蛋白质溶液中加入适当试剂，破坏了蛋白质的水化膜或中和了其分子表面的电荷，从而使蛋白质胶体溶液变得不稳定而发生沉淀的现象。下列方法可使蛋白质产生沉淀并可有效地用于蛋白质的分离。,第149页/共162页,盐析 在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化

46、钠等）使蛋白质溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析（salting out）。这是由于这些盐类离子与水的亲和性大，又是强电解质，可与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质颗粒表面的水膜。另外，大量中和蛋白质颗粒上的电荷，使蛋白质成为既不含水膜又不带电荷的颗粒而聚集沉淀。,第150页/共162页,另外，当在蛋白质溶液中加入中性盐的浓度较低时，蛋白质溶解度会增加，这种现象称为盐溶（salting in），这是由于蛋白质颗粒上吸附某种无机盐离子后，使蛋白质颗粒带同种电荷而相互排斥，并且与水分子的作用加强，从而溶解度增加。,第151页/共162页,调pH至等电点 当蛋白质溶液处于等电点pH 时，蛋白质分子主要以两

47、性离子形式存在，净电荷为零。此时蛋白质分子失去同种电荷的排斥作用，极易聚集而发生沉淀。,第152页/共162页,有机溶剂 有些与水互溶的有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水的亲和力大，能夺取蛋白质表面的水化膜，从而使蛋白质的溶解度降低并产生沉淀。,第153页/共162页,重金属盐 当蛋白质溶液的pH 大于其等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子（如Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等）结合形成不溶性的蛋白盐而沉淀。,第154页/共162页,生物碱试剂 生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂都

48、能沉淀蛋白质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等都能沉淀生物碱。因为一般生物碱试剂都为酸性物质，而蛋白质在酸性溶液中带正电荷，所以能和生物碱试剂的酸根离子结合形成溶解度较小的盐类而沉淀。,第155页/共162页,（四）样品的进一步分离纯化 常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。,第156页/共162页,1. 凝胶过滤层析 又称为分子排阻层析或分子筛层析。它是根据蛋白质分子大小和形状的差异建立起来的一种方法.也可用此方法进行蛋白质分子量的测定.,第157页/共162页,2. 纤维素柱层析法 该法是利用蛋白质的酸碱性质

49、作为分离的基础。离子交换纤维素（cellulose ionexchanger）是人工合成的纤维素衍生物，它具有松散的亲水性网状结构，有较大的表面积，使蛋白质大分子可以自由通过。因此常用于蛋白质的分离。,第158页/共162页,3. 亲和层析 亲和层析（affinity chromatography）分离技术是根据许多蛋白质对特定的化学基团具有专一性结合的原理。这些能被生物大分子如蛋白质所识别并与之结合的基团称为配基或配体（ligand）。亲和层析是一种极有效的分离纯化蛋白质的方法。,第159页/共162页,第160页/共162页,三、蛋白质的分析测定1.蛋白质含量的测定2.蛋白质纯度的鉴定3.蛋白质相对分子质量的测定,第161页/共162页,思考题：,1.记忆20种氨基酸及其分类.2.氨基酸的化学性质(两性解离).3.蛋白质的一级结构及其测定.4.蛋白质的高级结构(重点二级结构).5.蛋白质的性质有哪些.6.蛋白质分离纯化的方法有哪些.7.名词解释： 必需氨基酸、盐析、蛋白质的一级结构、凝胶电泳、蛋白质的二级结构、氢键、发夹结构、构象、蛋白质的四级结构、稀有氨基酸、超二级结构、氨基酸等电点、非蛋白质氨基酸、蛋白质的变性、结构域、构型、盐溶、蛋白质的三级结构、蛋白质的复性、分子杂交、蛋白质的沉淀作用、层析、两性离子、蛋白质的等电点、蛋白质折叠,第162页/共162页,