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1、1,转基因技术与作物育种,2,作物转基因育种就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经 DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。转基因作物（GMC，genetically modified crops）,什么是转基因育种?,3,与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很高，但是具有常规育种所不具备的优势：1.拓宽可利用的基因资源；2.培育高产、优质、高抗优良品种提供了崭新的育种途径；3.可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择；4. 可以大大提高选择效率，加快育种进程。此外，还可将植物
2、作为生物反应器生产药物等生物制品。,4,Traditional crossbreeding,Recombinant DNA techniques,5,二、转基因育种的程序,基因分离,体外重组,转化,转化体,安全性评价,结合常规育种,转基因品种,遗传稳定性评价,市场开发,载体的构建,农杆菌介导基因枪轰击,筛选,6,(一)目的基因的获得 根据获得基因的途径主要可以分为两大类： 根据基因表达的产物蛋白进行基因克隆； 从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。,1.根据基因表达的产物蛋白进行基因克隆 主要步骤如下：利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。局
3、限性：兼并密码子 效率低 未知基因及产物,分离蛋白质,明确氨基酸序列,推导核苷酸序列,人工合成,7,2.从基因组DNA或mRNA序列克隆基因,(1)同源序列法 (Homology Based Candidate Gene Method) 根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点克隆基因家族未知成员。,氨基酸序列比较,设计简并引物,PCR扩增,文库筛选/RACE,8,(2)表达序列标签EST是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包含了该基因足够的结构信息区，可以与其它基因相区分。主要是通过cDNA的途径获得。 获得EST的途径: 大规模cDNA文库测序 各种mRNA水平的
4、分析手段,mRNA,cDNA,反转录酶,cDNA文库,PCR,差异显示,抑制消减杂交,EST,RACE/文库筛选,dbEST,GenBank,9,(3)根据连锁图谱克隆目的基因 图位克隆技术(Map-based cloning),10,Marker,cM,1,0.8,a,Gene,c,bp,BAC,染色体步移,亚克隆,cDNA文库筛选,互补实验,精细定位,染色体步移,候选基因,11,(4)转座子标签法 转座子是染色体上一段可复制、移动的 DNA片段。当转座子插入到某个功能基因内部时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型；当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得到恢复。目前应用最
5、为广泛的转座子系统是Ac/Ds玉米转座子系统。,插入突变体,筛选突变DNA文库，PCR，RACE,鉴定性状遗传分析,转座子DNA探针,基因部分DNA探针,筛选野生型DNA文库，PCR，RACE,完整目的基因,互补实验,12,(5)差异显示法 在生物个体发育不同阶段，或不同的组织与细胞中或不同环境下，基因表达差异。即不同基因有序的时空表达方式，叫做基因的差异表达。差异显示PCR(differential display-PCR,DD-PCR)是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带。,叶mRNA,根mRNA,反转录,反转录,PCR,随机引
6、物+3 锚定poly(t)引物,PCR,PAGE,叶,根,13,(6) cDNA微阵列, cDNA 芯片cDNA序列（纯样）机器点样在支持物,与荧光标记的不同mRNA样品分别进行杂交,通过激光共聚焦扫描分析不同cDNA序列的杂交信号强度,判断该cDNA在不同mRNA样品中的表达丰度.,mRNA 1,mRNA 2,14,(6) 电子克隆 in silico cloning利用计算机技术, 依托现有的网络资源 ( EST数据库、核苷酸数据库、蛋白质数据库、基因组数据库等) ，采用同源性序列比对和归类分析、重叠区域组装和拼接等方法延长EST序列，直至没有与之同源的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认
7、为是相对应基因的全长cDNA，根据所得的cDNA序列设计囊括开放阅读框两端的引物，进行RT-PCR克隆出相应基因的方法类似于cDNA文库的筛选但更加方便和快速。,15,（二）目的基因重组质粒的构建,目的基因体外重组到适当的已改造的质粒中包括保存用中间载体（大肠杆菌寄主）：pBR322、pUC、 pBluescript K、pKS,pGEM-T 繁殖载体（大肠杆菌寄主）： JM109, TOP10 植物转化载体（农杆菌寄主）： pBI121, pCAM1001,16,分离基因,克隆到某中间载体,转化大肠杆菌,提取质粒,限制酶切/连接,克隆到植物表达载体,转化农杆菌,基因枪转化,pKS,pBR33
8、2,pGEM-T,JM109, TOP10,HindIII/EcroI T4 ligase,pBI121, pCAM1001,LBA4404, EHA,17,农杆菌:多用于植物基因工程. 包含Ti质粒T-DNA (Transferred-DNA), 可以转移进入植物基因组.,Tumor induced byA. tumefaciens,18,Ti Plasmid,T-DNA region,Left border,Right border,vir genes,ori,已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。,auxin,19,Ti
9、质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95156106D, 约有200kb组成。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型(octopine)胭脂碱型(nopaline)农杆碱型（agropine）农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine),Ti质粒的遗传特性及类型,20,Ti质粒的功能区域,（1）T-DNA区（transferred-DNA regions）： 农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤
10、的形成有关。（2）Vir区（virulence region） 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。（3）Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。（4）Ori区（origin of replication） 该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。,21,野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍
11、：Ti质粒分子量过大，一般在160240kb，比pBR322质粒大50倍左右；大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，不能通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因；T-DNA区内含有许多编码基因，其中Onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。,22,双元载体系统:binary Ti vector system,23,载体构建中常用的选择标记,如何选择和筛选转化体同样是一个重要问题。科学家家一
12、直试图把转化体带上一个标记，从而便于选择和筛选。至今己建立了许多标记基因，并已插入各种转化载体中，作为一种标记基因。,24,必须具备以下四个条件：编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；基因较小，可构成嵌合基因；能在转化体中得到充分表达；检测容易，并且能定量分析。细菌筛选标记基因： 产物给予细胞产生一种选择压力，致使未转化细胞不能生长、发育与分化。而转化细胞对该标记产生抗性，不影响其生长等，从而将转化细胞选择出来，例如， Cat（氯霉抗性基因）。植物筛选标记基因： 强调给转化细胞带上一种标记，起报告和识别作用，故称报告基因。,25,报告基因: Gus基因（-葡糖苷酸酶基因） 在植物细胞中所产生的葡
13、糖苷酸酶在检测上具有以下特点：在一定条件下与X-G1ucuionic acid （5-bromo-4-chioro-3-indoyl-D-glucuronic acid）底物发生作用，产生蓝色沉淀，既可以用分光光度计法测定，又可以直接观察到植物组织中形成的蓝色斑点。当加入4-甲基伞形酮基和葡萄糖苷酸时生成4-甲基伞形酮，发荧光（=465nm）。因而可以用荧光光谱法测定。由于荧光强度高，本底低，故荧光检测极为灵敏。检测容易、迅速并能定量，只需少量植物组织抽提液即可在短时间内测定完毕。价格便宜。,26,27,GFP（绿色荧光蛋白基因）;LUC (萤火虫荧光素酶基因);,报告基因:,28,启动子的选
14、择,35S, cauliflower mosaic virus 35S promoter,CaMV 35S is a strong promoter that is active in essentially all dicot plant tissues.,29,(三受体材料的选择 受体是指用于接受外源DNA的转化材料。良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件：1、高效稳定的再生能力；2、受体材料要有较高的遗传稳定性；3、外植体来源方便，如胚和其它器官等；4、对筛选剂敏感；5、转化率高,30,常用的受体材料有以下几大类型:,1.愈伤组织再生系统外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（
15、带有目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。缺点：遗传稳定性差、嵌合体 因此需要连续的再生系统,31,2.直接分化再生系统 外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定；缺点：材料局限，转化率低。,3.原生质体再生系统原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统；缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。,32,4.胚状
16、体再生系统是指具有胚胎性质的个体。优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。,5.生殖细胞受体系统以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。,33,（四）转基因方法概括起来说主要有两类：第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。第二类是外源目的DNA的直接转化。,34,1.载体介导转移系统最常见的转基因方法。将外源基因重组进入适合
17、的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(root-indcingplasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。,35,农杆菌共培养侵染,诱导愈伤组织,分化生芽,生根,叶盘转化法,(1)叶盘法 双子叶植物较为常用、简单有效的方法。,36,(2)真空渗入法将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。简便、快速、可靠，不需要
18、组织培养。(3)愈伤组织共培养(4)原生质体共培养,37,2.外源基因直接导入法（1）化学刺激法细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）,38,(2)基因枪轰击法 （微弹轰击技术micro-projectile bombardment) 将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了受体材料的限制，不必制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。单子叶
19、植物,39,1. 撕开果皮取出未成熟的胚.,2. 未成熟的置于培养皿中,高渗透介质,Transformation is performed by gene gun method,40,41,(4)微注射法 细胞操作： 利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。子房注射法或花粉管通道法： 具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作。操作简便、成本低。,42,（五）转化体的筛选和鉴定1.转化体的筛选外源目的基因转化频率低目的基因已被整合到核基因组并表达转化细胞更少使用特异性选择标记基因（selectable
20、marker genes）进行标记，有效地选择出真正转化细胞。常用选择标记基因： 抗生素抗性基因 除草剂抗性基因将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因，克隆到质粒载体上，与目的基因同时进行转化。标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。,43,2.转化体的鉴定 通过筛选得到的再生植株初步证明标记基因整合进入受体细胞。至于目的基因是否整合到受体核基因组、是否表达，还必须对抗性植株进一步检测。,DNA水平的鉴定 检测内容：是否整合、拷贝数、整合位置。 检测方法：特异性PCR（以外源基因两侧序列设计引物） Southern杂交（外源目的基
21、因序列为探针）,44,特异性PCR检测外源基因整合到受体,45,(2) 转录水平的鉴定常用的方法Northern杂交（标记的RNA为探针对总RNA杂交）RT-PCR 检测,mRNA,cDNA,PCR,46,47,（3）翻译水平的鉴定为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译，还必须进行翻译或者蛋白质水平检测。主要方法：Western杂交 免疫检测,48,（六）转化体的安全性评价和育种利用根据有关转基因产品的管理规定、在可控制的条件下进行安全性评价和大田育种利用研究。通过转基因方法往往难以直接获得理想的品种（系）原因：外源基因失活、纯合致死、花粉致死、其它性状变化等。因此获得转化体后，应结合杂交、回交、自交等常规转育手段，最终选育综合性状优良的转基因品种。,49,第二 转基因作物的遗传特点 少数外源基因整合到植株能稳定遗传，正常表达，符合孟德尔遗传。 大多失活或表现复杂的遗传方式。原因：外源基因受宿主基因组排斥而发生片段丢失、重排； 多拷贝； 整合随机性；一、整合机制1、同源重组2、位点特异性重组3、转座4、异常重组,50,二、整合后外源基因表现不表达1、基因丢失2、基因沉默表达1、符合孟德尔遗传2、独立转化体之间差异3、无规律,
