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1、第一节 光谱分析技术,学习目标,1.能说出临床生物化学检验常用分析技术名称2.掌握光的吸收定律，理解吸光系数的意义和应用3.叙述分光光度技术的定量测定方法4.知道火焰光度法、比浊法、原子吸收分光光度法荧光分析法的原理、影响因素和主要应用,是能的一种表现形式，是电磁波的一种。光在真空中以直线方式传播，在不同的介质处发生反射、折射、衍射、色散、干涉和偏振等现象。可用波长、频率、传播速度等参量来描述即光具有“波动性”。光的颜色即由光的波长决定，人眼能感觉到的光称为可见光，其波长在400750nm之间。在可见光之外是 红外光7601000nm 紫外光200400nm,光,光子的能量与波长的关系为,E=
2、h= hc 式中E为光子的能量（J：焦耳）为频率h为普朗克常数（6.6310-34JS）c为光速为光的波长 因此，不同波长的光，其能量不同，短波能量大，长波能量小。,什么是光谱分析技术？,光的波长（） 单位用纳米（nm）各种化学物质都具有一定的光谱特性，表现在能选择性吸收、发射或散射某种波长的光。利用物质的吸收光谱、发射光谱或散射光谱特征对物质进行定性、定量分析的技术称为光谱分析技术。,光谱分析技术原理：,利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。光谱分析技术分类：发射光谱分析技术：火焰光度法、荧光法吸收光谱分析技术：紫外、红外、原子、可见光分光光度
3、法散射光谱分析技术：比浊法,一、分光光度技术的基本原理,（一）光的吸收现象和吸收曲线物质的颜色是由于其分子选择性吸收了可见光范（400760 nm）内不同波长的光线后透过或反射出相应颜色的结果。不同浓度的一种被测物质对不同波长光线的吸收点绘制成曲线，则称为吸收光谱（吸收曲线）。1.吸收曲线的峰值高低和溶液浓度有关2.溶液浓度愈高，吸收光强度愈大。事实上：无论物质有无颜色，当有一定波长光线通 过时都能产生一定程度的吸光度。 不同分子结构的物质，浓度不同，尽管峰 值高低不易，但吸收峰位置曲线形状相同。结论：各种物质吸收曲线的形状和物质的特征有关，故可作为物质定性的依据。,光的显色原理,若把某两种颜
4、色的光，按一定的强度比例混合，能够得到白色光，则这两种颜色的光叫做互补色。图中处于直线关系的两种光为互补色。如绿光和紫光为互补色，黄光和蓝光为互补色等等。各种溶液会呈现出不同的颜色，其原因是溶液中有色质点（分子或离子）选择性地吸收某种颜色的光。实验证明：溶液所呈现的颜色是其主要吸收 光的互补色。如一束白光通过高 锰酸钾溶液时，绿光大部分被选 择吸收，其它的光透过溶液。从 互补色示意图可以看出， 透过光 中只剩下紫色光，所以高锰酸钾 溶液呈紫色。,（二）光的吸收定律,溶液颜色的深浅与浓度之间的关系可以用吸收定律来描述。它是由约翰海因里希朗伯和奥古斯特比尔相结合而成的，所以叫朗伯-比尔定律。当一束
5、平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，与其吸光度A与吸光度C及吸收物质的浓度厚度b成正比。溶液对光的吸收 当一束强度为I的平行单色光照到溶液时，一部分光被溶液吸收，一部分光被界面散射，其余的光则透过溶液，如图所示,结论： I0=I a+ I r+ I t I0-入射光强度 I a-吸收光强度 I r-反射光强度 I t-透射光强度 通常由于I r很小可忽略不计，上式可简化为 I0=I a+ I t透射光I t与入射光强度I0之比为透光率或透光度，用T表示： T= I t/ I 0透光率的负对数称为吸光度或光密度或消光度，用A表示： A=lgT=lg1/T=lgI 0/ I t,蓝色I,
6、白光I,0,I,黄光,t,a,I,r,吸光度越大，表示该物质对光的吸收越强。透光度和吸光度都是用来表示入射光被吸收的程度，它们之间可据式相互换算。 实验证明：单色光经过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度 有关，而且还与溶液的厚度以及溶液本身对光的吸收性能有关。 其规律可用下式表示为 AKCL 式中： A吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）； K某溶液的消光（吸收）系数； C溶液的浓度； L光程，即溶液的厚度。Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。,溶液吸光度和浓度的关系,1.标准曲线在一定浓度范围内呈直线关系2.当物质浓度超过某一定数值时，其吸光
7、度的增加不再与浓度呈正比例 不再遵守朗伯-比尔定律故实际工作中，应根据待测物质的线性范围确定标准系列的浓度值A-C曲线的数学表达式： y=ax+by：吸光度 x：浓度a：斜率 b：截距,二.吸光系数一.吸光（消光）系数表达式,吸光系数 Aa表示 a = C（g/L）.L(cm) 单位 L/g.cm摩尔消光系数 A表示 = C（mol/L）.L(cm) 单位 L/mol.cm 百分消光系数 A E 表示 E = C（g/dl）.L(cm) 单位是dL/(g.cm)摩尔消光系数与百分消光系数的换算关系： = E * M（摩尔质量） 10,mol1cm，入,1%1cm，入,mol1cm，入,1%1c
8、m，入,（二）吸光系数的应用,1.可作为某物质吸光能力大小的特征数据2.判定测定方法的灵敏度高低3.计算待测物的浓度吸光系数是定性分析的重要依据，也可作为判断该物质纯度的指标，在相同的吸光度情况下，K值越大，C越小。则该测定法灵敏度越高。临床上，利用待测物的吸光系数和实际测得的吸光度值。计算待测物的浓度。 AC= - K * L,（一）分光光度计基本组成,可见光光度计721、721-A、722、723型分光光度计等紫外分光光度计751、752、753型分光光度计等紫外-可见分光光度计贝克曼DU500系列紫外/分光光度计,可见分光光度计,722型分光光度计示意图,722型分光光度计使用方法,（1
9、）预热仪器 将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止光 电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切 断。（2）选定波长 根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。（3）固定灵敏度档 在能使空白溶液很好地调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度 较低的挡，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。但换挡改变灵敏 度后，须重新校正“0%”和“100%”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。（4）调节T=0% 轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”（此时试样室是打开的）。（5）调节T=100% 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯
10、溶剂）的比色皿放入比色皿座架中 的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，使 数字显示正好为“100.0”。（6）吸光度的测定 将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调 节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿 座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光 路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断 光路。重复上述测定操作12次，读取相应的吸光度值，取平均值。（7）浓度的测定 选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋 钮，使得数字
11、显示为标定值，将被测样品放入光路，此时数字显示值即为该待测 溶液的浓度值。（8）关机 实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。,四.分光光度技术的定量测定方法,以可见光为光源，通过测定有色溶液对某波长光线的吸收程度来确定其含量的分析方法称可见光光度法。用波长小于400nm的紫外光源测定无色物质的方法称为紫外分光光度法。临床生化检验需要测定的各种体液化学成分基本无色或颜色很浅，故需在适当条件下反应后生成具有颜色或具有紫外光吸收的物质，而适合于可见或紫外分光光度分析。,一对比法（标准对照法）,己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根
12、据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为： Cu=(AuCs)/As其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量和标本管浓度相近。,步骤： （1）先配制五种以上标准浓度的 溶液。 （2）显色反应 （3）测出每种溶液的吸光度A。 （4）做AC标准曲线图，如图 所示有了标准工作曲线便可对溶液进行测量。在同样的条件下，用仪器测出A后，查标准曲线即可得被测溶液的浓度值Cx。A-C曲线的数学表达式： y=ax+by：吸光度 x：浓度a：斜率 b：截距,（二）标准曲线法,制作和应用标准曲线时应注意下面几点：,（1）设置的
13、浓度范围须足够大（2）为减少器材及操作误差，每个浓度的标准液做3次平行测 定（3）吸光度范围应在0.051.0之间较适宜（4）标准曲线在使用过程中，应定期以定值质控血清校其 准确性，一般在试剂更换或分光光度计检修后，重新绘制。（5）当待测液吸光度超过线性范围时，应将样本稀释后再 测定。,五.火焰光度法,Na+、K+测定可采用火焰光度法。 原理：火焰光度法是一种发射光谱分析法，利用火焰中激发态原子回降至基态时发射 的光谱强度进行含量分析。火焰光度法定量关系 I=a c式中, I -特征谱线强度; c -待测物浓度; a -与元素激发电位、温度及试样成份有关的参数;用火焰作为激发光源时,因燃烧稳定
14、,且组份在火焰中分散度好,此时a为常数; b -自吸情况参数,当C很低时,b=1。此时, 自吸现象可忽略，则:I=a c该法可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，该方法属于经典的标准参法， 优点：结果准确可靠，广为临床采用医学教育网搜集整理。 通常采用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和内标准法。 内标法：标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素进行测定，一般是加入锂内 标，测定的是锂/钠或锂/钾电流的比值，而不是单独的钠或钾的电流，这样， 可减小燃气和火焰温度波动等因素引起的误差，因而有较好的准确性。,b,六.比浊分析法,比浊分析法（浊度法），属于散射光谱分析。原理：当光线通过一
15、个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分， 吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为比浊分析法临床应用：最多是免疫比浊法利用抗原抗体的特异性结合形成复合物，通过测定复合物形成量的多少，对抗原抗体进行定量的方法。特点：（1）要有特异性的抗体 （2）抗原抗体的比例要适当 （3）溶液介质的PH、离子强度等要适宜。影响因素：1.悬浊液的散射光强度主要和颗粒的数量有关2.注意掌握反应温度3.溶液的PH值可影响沉淀的形成及颗粒的大小4.悬浊液的稳定性较差，需及时比浊5.稀释缓冲液中的电解质与非电解质对免疫复合物的形成和稳定性有影响6.适当选择滤光片或入射光波长,七.原子
16、吸收分光光度法,原理: 又称原子吸收分光光度法是基于蒸汽相中待测元素的基态原子对其共振辐射的吸收强度来测定试样中该元素含量的一种仪器分析方法。它是测定痕量和超痕量元素的有效方法。 特点： 具有灵敏度高、干扰较少、选择性好、操作简便、快速、结果准确、可靠、应用范围广、仪器比较简单、价格较低廉等优点，而且可以使整个操作自动化，因此近年来发展迅速，是应用广泛的一种仪器分析新技术。 方法： 在温度吸收光程，进样方式等实验条件固定时，样品产生的待测元素相基态原子对作为锐线光源的该元素的空心阴极灯所辐射的单色光产生吸收，其吸光度（A）与样品中该元素的浓度（C）成正比。即 A=KC 式中，K为常数。据此，通
17、过测量标准溶液及未知溶液的吸光度，又巳知标准溶液浓度，可作标准曲线，求得未知液中待测元素浓度。 应用： 主要适用样品中微量及痕量组分分析。,八.荧光分析法,定义： 利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以 进行定性或定量分析的方法。原理： 物质的分子吸收紫外光或可见光后，由电子基态能级跃迁至激发态能级。 处于激发态的分子不稳定，通过各种方式失去能量，返回基态。若分子首 先通过碰撞和系统内转换等方式失去部分能量，下降至电子第一激发态的 最低振动能级，然后再发射一定波长的光返回电子基态的任一振动能级， 则被发射的光称为荧光。显然，荧光的能量小于激发光能量，波长则长于 激发光。荧光的平均寿命很短，除去激发光源，荧光立即熄灭。特点： 灵敏度更高 选择性强 使用简便,课后习题,选择：1.可见光谱区的波长范围（ ）A.200300nm B.300400nm C.400600nm D.400760nm E.7001000nm2.分光光度法测定中制作标准曲线广泛采用的曲线图形为（ ）A.T-C曲线 B.IgT-C曲线 C.A-C曲线 D.A-曲线 E.以上都不对3.某物质溶液吸收光谱曲线上最大吸收峰所对应的波长，称为该物质的（ ）A.特殊波长 B.最大吸收波长 C.最小吸收波长D.综合波长 E.以上都不对名词解释什么是光谱分析技术？什么是吸光度？什么是吸光系数？,
