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1、1,铁器在空气中暴露日久会生锈，洁白的银器也会由于氧化变黑。人的机体与金属一样也会受到氧化而导致“生锈”，罪魁就是自由基。,2,1956 年英国分子生物学家Harman 首次提出： “氧化应激决定寿命”，即自由基衰老学说， 认为衰老是自由基引起的组织随机毒害的结果。 Harman, D. J. Gerontol. 1956; 11: 298-300,氧化应激是由于氧自由基过量生成和(或)细胞内抗氧化防御系统受损,导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集, 从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。,生成增加，消除减少,Physiol Rev. 2002; 82: 4795.,3,4,Free Radi
2、cal Biology & Medicine (IF=5.423)Free Radical Res (IF=2.878)Antioxid Redox Signal (IF=8.456)Redox Report (IF=1.732),Journals of impact factor,5,Impact Factor Distributions,IF10.0 = 102 journals (1.6%)EliteIF5.0 = 228 journals (3.6%)ExcellentIF3.0 = 597 journals (9.3%)Very GoodIF2.0 = 869 journals (1
3、3.5%)GoodIF1.0 = 2,020 journals (31.5%)FairIF1.0 = 2,601 journals (40.5%)Poor,From a total of 6,417 SCI indexed journals as of March, 2008,6,自由基的概念,7,自由基（Free radicals） 是指外层电子轨道带有一个或多个未成对电子的分子、原子、离子或者基团。,8,活性氧（ROS） 是指分子氧在还原过程中的一系列中间产物。 活性氧包括以自由基形式存在和不以自由基形式存在的具有高活性的中间产物。,GPX,9,常见自由基的理化性质,10,常见自由基,活性
4、氧 （Reactive Oxygen Species, ROS）活性氮（Reactive Nitrogen Species，RNS）,以碳、氧、氮或硫原子为中心的自由基,11,活 性 氧（ROS）,NO. + O2- ONOO-,活 性 氮（RNS）,过氧亚硝基阴离子,12,超氧阴离子 (O2-),化学性质：O2-在细胞内可直接导致DNA损伤，并可使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和肌酸激酶失活，其细胞毒性作用主要通过衍生产生H2O2和OH。,清除：细胞内有SOD起清除作用。,13,过氧化氢 (H2O2),化学性质：H2O2的性质较稳定，半衰期最长，可以穿透大部分细胞膜，因而可以发挥重要的信使功
5、能，但这一特性也增加了其细胞毒作用。,清除：H2O2在体内可经过氧化氢酶作用降解为水和氧气。,“长效”“稳定”,14,羟自由基 (OH),化学性质：OH是已知活性最强的氧化剂，化学性质极为活泼，几乎可以与所有细胞成分发生反应，对机体危害极大。但是由于其作用范围小，仅能与它的邻近的分子反应。,清除：主要通过抗坏血酸、GSH（或其他的硫醇）、褪黑色素、NADPH等活性物质及细胞色素P450体系降解和清除。,“寿命短”“稳定差”,15,过氧亚硝基阴离子（ONOO-）,化学性质：ONOO-作为一种强氧化剂，可以介导蛋白巯基和非蛋白巯基的氧化，并可氧化细胞膜脂、蛋白及DNA，导致细胞损伤和疾病的发生或介
6、导信号转导。,降解：在碱性条件下，ONOO-比较稳定。一旦质子化，立即分解产生类羟基和NO2自由基。,16,17,机体对自由基的防御,18,19,氧化应激与心血管疾病,20,在生理情况下活性氧可维持在极低水平，参与机体生长发育的调控，信号转导、诱导增殖与分化、诱导凋亡，调节运动等多种生理过程，在生物体内发挥着重要的功能。,生成增加，消除减少,机体损伤,21,动脉粥样硬化,是动脉硬化性血管病中最常见的一种。动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样。 引起管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。,22,23,氧化应激与动脉粥样硬化,ATVB. 2005;25:29-38.,24,NADPH Oxidase Ac
7、itvity,O2.-,NADPH氧化酶与动脉粥样硬化,25,氧化应激与高血压,26,自由基的信号转导途径,27,氧自由基参与信号转导通路,EGF Receptor Protein Tyrosine Phosphatases Insulin Receptor Kinase Activity Cytoplasmic Protein Kinases MAPK Cascades Protein Kinase C Isoforms Cytosolic Ca2+ Concentrations Transcription Factor,28,Role of ROS in EGF Receptor-Medi
8、ated Signalling,MAPK信号级联反应,Stimulus,Growth factors, Mitogen, GPCR,p38 MAPK,Stress, GPCR, Inflammatory cytokines, Growth factors,Stress, Growth factors, Mitogen, GPCR,MEKK1, 4, MLK3, ASK1,MEKK2, 3, Tpl2,MLK3, TAK, DLK,Raf, Mos, Tpl2,MKK3/6,MEK1/2,MKK4/7,MEK5,ERK1/2,MAPKKK,Growth, Differentiation, Dev
9、elopment,Inflammation, Apoptosis, Growth, Differentiation,Growth, Differentiation, Development,ERK5/BMK1,JNK1,2,3,MAPKK,MAPK,Biological responses,30,自由基的检测,31,化学发光法,检测原理：活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释放能量，产生化学发光。检测对象：超氧阴离子、羟自由基、H2O2 和脂质过氧化产生的自由基都可以产生化学发光。优点：灵敏、快速、操作简单、价格低廉。 缺点：非特异性。另外，几乎所有的氧化剂，如次氯酸、高锰酸钾等都可以与发光增效
10、剂反应，产生化学发光，严重干扰活性氧的检测。Fe2+也可以产生非常强的化学发光。,32,二氢乙啶(Dihydroethidium, DHE),检测原理：可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的超氧阴离子氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS经典检测方法。,33,Circulation. 2008;117:1045-1054.,Determination of ROS by DHE Staining,34,检测原理：在碱性条件下，光泽精与超氧阴离子等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶(N2me
11、thylacridan) 。并发出450nm的激发光，测量此激发光的强度即可定量产生的超氧阴离子的浓度。可以定量，但检测时间长，并需要新鲜组织样本。,Lucigenin (光泽精)-Enhanced Chemiluminescence,35,Determination of ROS by Lucigenin-Enhanced Chemiluminescence,36,检测原理：DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，检测D
12、CF的荧光就可以得到细胞内活性氧的水平。,2, 7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA),37,Br J Pharmacol. 2008;154(1):105-13.,Determination of ROS by DCFH-DA Staining,38,39,40,42,影响自由基的药物,43,影响自由基的药物,抗氧化药物促氧化药物“以毒攻毒”,44,抗氧化药物, 维生素类及内源性物质，如维生素E、维生素C、维生素A、GSH等； 活性氧防御酶类，如SOD、过氧化氢酶、过氧化物酶、Co-Q类等； 化合物，如SOD模拟化合物、普罗布考以及一些传统药物如硫酸锌、甘露醇、钙拮抗药、血管紧张素转化酶抑制药、肼肽嗪、乙酰半胱氨酸、2受体激动药及阻断药等； 中药及其有效成分，如银杏、丹参、云芝及其所含的黄酮类、酚类、多糖类等.,45,46, 化学性直接产生自由基及活性氧； 通过作用于机体防御机制，促进机体内自由基、活性氧产生。巨噬细胞、中性粒细胞在对侵入机体的抗原通过吞噬作用而进行消化分解的同时，产生超氧化物、过氧化物以破坏抗原。,促氧化药物,47,莫特沙芬进入机体后可选择性定位并在癌细胞中蓄积，破坏细胞代谢，产生ROS并促使细胞凋亡。临床前研究显示莫特沙芬可加强放疗及几种常用化疗药的疗效。,促氧化药物,
