生物药物分析与检验第三章免疫分析法课件.ppt

《生物药物分析与检验第三章免疫分析法课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物药物分析与检验第三章免疫分析法课件.ppt（150页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第三章 免疫分析法,一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法,主要内容,一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法,主要内容,免疫学是研究免疫系统的结构与功能，了解其在免疫应答反应中对机体有益的防卫功能和有害的病理损伤的机制，研究有效的免疫措施，实现以防病，治病为目的的一门现代医学学科。,一、概述,什么叫免疫分析？基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术手段。抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内，也可以发生在体外。高选择性和低检出限。在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效应作用。体外的抗原

2、抗体结合反应主要用于抗原或抗体的检测，用于免疫学诊断。,(1) 在实验药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况；(2) 在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有交叉的药物血液浓度进行监测；(3) 在药物生产中，从发酵液或细胞培养液中快速测定有效组分的含量，以实现对生产过程的在线监测；(4) 对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。,在药物分析中，免疫分析法的应用主要集中在以下几方面：,免疫分析： 利用抗原与抗体的特异性结合作用，来选择性识别和测定

3、，可以作为抗体或抗原的待测物.免疫分析方法,免疫分析检测的发展,放射免疫检测（兴起于20世纪70年代),酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用）；,以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术（20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。,可逆性,比例性反应阶段性,特异性,免疫分析法的特点,特异性,特异性：抗原与抗体结合反应的专一性分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性,可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体，解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。影响因素： 抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结合越牢固，越

4、不易解离 环境因素对复合物的影响pH、离子强度,比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系前带(prezone)：抗体过量后带(postzone)：抗原过量等价带(equivalence zone)：抗原抗体比例合适,一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法,主要内容,抗原（antigen,Ag)：是一类能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫应答产物（抗体和致敏淋巴细胞)在体内外发生特异性结合的物质抗原的两种特性：免疫原性和抗原性（免疫反应性）免疫原性（immunogenicity),能刺激机体发生免疫应答，产生抗体和致敏淋巴细胞的能力。免疫反应性

5、能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力。 凡具有免疫原性和抗原性的物质称为完全抗原 只有抗原性而不具有免疫原性的物质称为半抗原 半抗原+蛋白质完全抗原 赋予半抗原以免疫原性的蛋白质称为载体。,2.1 定义,1.抗原的免疫原性,抗原物质必须具备的条件： 一、异物性 二、一定的理化性状 三、完整性 四、宿主的遗传性,一、异物性,异物是指化学结构与宿主的自身成分相异或机体的免疫细胞从未与它接触过的物质。异物性的物质包括以下几类： 1、异种物质 如：马血清蛋白、各种微生物及其代谢产物对人体而言都是异种物质，具有强的免疫原性。 2、同种异体物质 如：ABO血型抗原、人类主要组织相容性抗原。 3、

6、自身抗原物质 如：自身组织成分结构改变、隐蔽性自身成分暴露构成自身抗原。,二、一定的理化性状,大分子胶体物质 凡具有免疫原性的物质，分子量都较大，一般在10kDa以上,在一定范围内,分子量越大免疫原性越强。一定的化学组成和结构 从化学组成来看，凡含有芳香族氨基酸（尤其是酪氨酸）的蛋白质，其免疫原性较强。从结构来看，结构越复杂其免疫原性越强。分子构象与易接近性 分子构象是指抗原分子中一些特殊化学基团的三维结构，它决定抗原分子是否能与淋巴细胞表面的抗原受体相互吻合。易接近性是指抗原分子的特殊化学基团与淋巴细胞表面相应的抗原受体相互接触的难易程度。,三、完整性,具有一定理化性状的物质须经非消化道途径

7、进入机体（包括注射、吸入、混入伤口等），并接触淋巴细胞，才能成为良好抗原。如果是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破坏了其结构，就丧失了免疫原性。自然界中天然的抗原物质有：蛋白质、多糖、核蛋白,四、宿主遗传性,抗原的免疫原性也与机体的应答能力有关，同种动物不同个体对同一种抗原的免疫应答存在明显的差异，这种差异受遗传因素控制，控制免疫应答的基因称为免疫应答基因（immune response, Ir)。,2.抗原的特异性,抗原决定簇（基）载体决定簇和半抗原决定簇共同抗原和交叉反应,一、抗原决定簇,1、概念 抗原决定簇（antigenic determinant, AD)是指抗原中决定抗原特异性的

8、特殊化学基团，又称为表位（epitope)。表位的性质、数目和空间构象决定着抗原的特异性。抗原通过AD与相应淋巴细胞表面的抗原受体结合，激活淋巴细胞，引起免疫应答。2、种类和数量 一个抗原分子可以有一种或多种不同的AD ，一种AD决定着一种特异性，多种AD决定着多种特异性3、部位 位于抗原表面的AD能直接被相应淋巴细胞所识别，称功能性决定簇，存在抗原分子内部的AD无激发免疫应答的功能，称隐蔽决定簇。只有经理化因素处理后，使之暴露可能成为新的功能决定簇。,4、大小 抗原决定簇的大小与相应抗体的抗原结合部位相当。一个蛋白质抗原决定簇含5-7个氨基酸残基一个多糖抗原决定簇含5-7个单糖一个核酸半抗原

9、决定簇含6-8个核苷酸5、抗原结合价（antigenic valence)是指能和抗体分子结合的抗原决定簇的总数。半抗原为一价天然抗原的分子结构复杂，分子表面有多个决定簇为多价,构象决定簇：序列上不相连而依赖于蛋白质或多糖的空间构象形成的决定簇，多暴露于分子表面。顺序决定簇：一段相连的氨基酸序列所形成的决定簇，多位于抗原分子内部。功能性AD：分子表面，易被识别。隐蔽性AD：分子内部。B细胞决定簇：分子表面。T细胞决定簇：分子内部。,二、AD的分类,三、共同抗原和交叉反应,两种来源不同的抗原，除各有其主要的特异性抗原决定簇外，相互之间也存在部分相同的抗原决定簇，这种共有的抗原决定簇称为共同抗原。

10、亲缘关系很近的生物之间存在的共同抗原称为类属抗原。无种属关系的生物之间存在的共同抗原称为异嗜性抗原。一种共同抗原刺激机体产生的抗体，可与其他含有共同抗原的物质发生结合反应，称为交叉反应。,2.2 药物分子的抗原性,1、药物分子的免疫原性 大多数的药物分子通常都是半抗原； 一些蛋白类药物、多肽类药物、激素类药物也是完全抗原。2、药物分子的抗原特异性 药物分子和蛋白质载体结合后，抗原特异性可能会发生改变。,3、药物分析中，为了得到高效价的抗血清，通常会与蛋白质载体合成人工抗原进行试验。常用载体：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破伤风类毒素（TT）、钥孔蛋白（KLH）等。,（1）半抗原和

11、载体结合的化学反应,多肽类激素：活化蛋白质或多肽的游离羧基形成肽键；与蛋白质或多肽的游离氨基缩合形成肽键甾体：甾体激素的羟基和酮基不能直接和载体蛋白形成有效的共价键，需要制备甾体的衍生物，通过含游离羧基的甾体衍生物与载体蛋白相连抗生素：-内酰胺环在偏碱性条件下可以与蛋白质的自由氨基以酰胺键的形式共价结合；氨基糖苷类抗生素用碳化二亚胺为连接剂实现药物和载体蛋白的连接,在选择结合半抗原的化学反应时，应考虑不同的连接方式可能对抗体的专一性产生不同的影响。半抗原没有可以结合的官能团时需要合成适当的衍生物。为得到特定抗原决定簇相对单纯的合成抗原，需要根据半抗原的化学特性及连接产物的化学特性选择连接的半抗

12、原。,（2）半抗原和载体的选择原则,半抗原选择原则：最好含有芳香结构；应考虑抗原抗体反应的微环境；合理利用分子类似物之间的交叉反应。,载体选择原则：应考虑载体对检测系统的影响：选择的载体应和检测体系不发生交叉反应；用于包被合成抗原的载体和用于免疫动物产生抗体的合成抗原的载体蛋白不同。免疫过程中考虑载体效应的影响：抗体的特异性依赖于半抗原分子结构中的免疫决定区，但整个载体蛋白大分子对于抗体反应的性质和量也有影响；应使用相同载体的合成抗原制备半抗原抗体。,（3）合成抗原的测定,定性测定方法： 光谱分析：半抗原和载体蛋白的结合导致蛋白构象的改变，改变程度和半抗原的结合量有关，半抗原结合量越大，构象改

13、变程度越大。 热力学分析：半抗原和载体蛋白结合后热力学特征会有变化，差异可通过差示扫描量热法（DCS）等方法测定。,定量测定方法 相对含量测定法：通过ELISA法比较半抗原与载体蛋白的相对结合量。绝对含量测定法：半抗原具有与载体蛋白完全不同的广谱吸收特征，且半抗原在此特定波长下具有较强的吸收；或能利用特定的化学反应定量测定半抗原的量，且不与载体蛋白发生反应。,一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法,主要内容,免疫分析实际上是一种特殊的试剂分析，特点是抗体成为分析试剂。,1、抗体的结构与功能,抗体泛指与待测分子特异性结合的蛋白质分子，包括免疫球蛋白（immunog

14、lobulin）, 受体（receptor）和其他结合蛋白质，主要是免疫球蛋白，常用的是IgG分子 .,抗体（antibody，Ab）：是由抗原进入机体刺激B细胞分化增殖为浆细胞而合成并分泌的一类能与相应抗原发生特异性结合并产生免疫效应的含有糖基的球蛋白。抗体分布于体液（血液、淋巴液、组织液及粘膜的外分泌液）中，主要存在于血清内。,1. 抗体（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。 2. 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig

15、）结构性概念 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。所有抗体都是免疫球蛋白，但是并非所有免疫球蛋白都是抗体。,免疫球蛋白的基本结构,IgG分子基本结构是由四个肽链组成的，二条较小的轻链和二条较大的重链，轻链与重链是由二硫键连接形成，分为氨基端（N端），羧基端（C端）。,抗体的基本结构,轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体；单体是构成所有免疫球蛋白分子的基本结构；所有抗体的单体都是四条肽链的对称结构，即：两条糖基化重链(H)和两条非糖基化轻链(L)；每条重链和轻链分为氨基端(N端)和羧基端(C端)。,IgG分子由四条多肽链构成，以二硫键相连，有三个功能区。抗体在F

16、ab区结合抗原分子，同时通过hi区的转动以适应不同距离的抗原决定簇。与抗原结合后，IgG分子构象改变，暴露出Fc上的活性位点，从而表现出固定和激活补体以及粘结单核细胞等亲细胞反应的功能。,Fab：抗原结合片段Fc：可结晶片段,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,巯基乙醇还原,胃蛋白酶（pepsin）水解片段,裂解部位，铰链区H链间二硫键（C端）裂解片段，F（ab）2，无Fc片段与抗原结合可发生凝集反应,木瓜蛋白酶（papain）水解片段,裂解部位，铰链区H链间二硫键（N端）裂解片段，2个Fab（54KD），一个Fc（50KD）,Fab与抗原结合，不发生凝集反应。,一、多克隆抗体（polyclonal ant

17、ibody） 1. 定义：抗原分子通常具有多个抗原决定簇，动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体称为多克隆抗体（polycolonal antibody, PcAb）。 2. 实际意义 （1）预防、治疗感染性疾病（特异性差，可发生超 敏反应） （2）临床诊断,二、单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb） 1. 定义：由单一克隆B细胞杂交瘤产生的、只识别 抗原分子某一特定抗原决定簇的、具有高度特异性的 抗体。每种单克隆抗体其类、亚类、型及亲和力完全 相同，具有高度均一性。 2. 特点

18、 具有高度均一性。 3. 杂交瘤细胞 骨髓瘤细胞无限增殖； 免疫B细胞合成、分泌特异性抗体。 4. 杂交瘤技术 HAT培养基：次黄嘌(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺 嘧啶核苷(T)。,三、基因工程抗体 基因工程抗体是通过PCR技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体，被广泛应用于疾病的临床诊断、预防和治疗及基础理论研究等领域。 人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）； 人改型抗体（reshaped humanized antibody）； 小分子抗体； 双特异性抗体（bispecific antibody）等。,、,抗体的功能：,清除侵入机体的微生

19、物，寄生虫等异物，中和它们所释放的毒素或清除某些自身抗原。,初次反应，再次反应和回忆反应产生抗体。,初次反应，再次反应和回忆反应产生抗体。,抗体的规律：,2抗体作为分析试剂的评价,抗体的特异性是无与伦比的，不需或只需要简单的预处理。有较高的稳定性。这两点奠定了分析免疫高度灵敏和高度专一的基础。此外，抗体还有一个独特的性质：每个抗体分子有两个抗原的结合点，即多价性。然而抗体缺乏高灵敏试剂应具备的分析信号反差。,3、抗体的制备,（1）常规抗血清（多克隆抗体）：指人工被动免疫后制成的多克隆抗体，是免疫分析中的重要工具。免疫原的制备、动物免疫、放血、抗血清分离及抗血清的分析鉴定。,免疫原的制备,免疫原

20、由质量好的抗原与佐剂制成。通常有免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。水剂由无菌生理盐水将抗原制成一定浓度的免疫原。弗氏佐剂是由一定量的羊毛脂和石蜡油，以及一定浓度的分支杆菌混合而成，经研磨达到油包水的程度。不完全福氏佐剂即不含有分支杆菌。,动物免疫,通常的免疫动物为家兔和羊。免疫的部位多采用脚掌、腹股沟淋巴结、大腿肌肉、皮下多点、静脉。免疫抗原量通常为110mg或50100mg。,试血及效价测定,家兔的试血通常可由耳缘静脉取血，取血量0.5ml。不同稀释度的抗血清和1%的血细胞悬液按1:1混合，37保温2h后观测血细胞的凝聚情况，即可测得免疫血清的效价。,（2）单克隆抗体,单克隆抗体是建

21、立在经细胞融合而获得的杂交瘤细胞基础上的。所获得的抗体具有均一的特异性。高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞细胞培养法 & 接种动物体内生产法,制备步骤,2、抗体的纯化,利用化学方法提纯或浓缩某一类的免疫球蛋白。利用免疫吸附剂和亲和色谱得到免疫学上专一性的抗体。,2022/12/9,59,沉淀分离,通过改变溶液的条件或添加某种物质，降低溶液中某一成分的溶解度，使其从溶液中沉淀析出，与其它成分分离的技术。是纯化生物大分子物质常用的经典方法包括盐析沉淀法、有机溶剂沉淀法和非离子聚合物沉淀法等。,2022/12/9,60,（一）盐析法,在物质的水溶液中

22、添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过程称为“盐析”。优点：成本低，不需要昂贵的设备；操作简便，安全；对许多生物活性物质具有稳定作用；对pH、温度要求不严格。缺点：分离效果有限,2022/12/9,61,盐析的基本原理,蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质亲水基团、与水形成水化膜的程度、以及所带有电荷的情况决定的。当中性盐加入蛋白质溶液中，盐离子对水分子的亲和力大于蛋白质，于是减弱甚至消除蛋白质分子周围的水化膜。同时，盐离子所带的电荷中和部分蛋白质分子表面电荷，更加导致其溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。,2022/12/9,62,盐类和浓度的选择,常用的中性盐有硫酸铵

23、、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等硫酸铵最为常用，其优点是：溶解度大；温度系数小；密度小，有利于析出蛋白的离心分离；蛋白沉淀物在2 mol/L3 mol/L硫酸铵溶液中稳定，低温下可保存一年；价廉易得；分离效果比其它盐好。但硫酸铵缓冲能力比较弱，pH难控制；铵离子干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。高浓度盐析法是粗纯样品的常用方法。,2022/12/9,63,脱盐,蛋白质用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的方法有：透析法超滤法葡聚糖凝胶G50层析法。,2022/12/9,64,（二）有机溶剂沉淀法,利用待分离物质与杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的

24、某种有机溶剂，使某一溶质沉淀析出，从而与其它成分分离的方法。,有机溶剂破坏溶质分子周围的水化层；有机溶剂降低溶液的介电常数，使蛋白质的溶解度降低。,2022/12/9,65,优点：分辨率比盐析法高，即一种溶质发生沉淀的有机溶剂浓度范围比较窄；溶剂容易除去，并可以回收；沉淀无需脱盐，易于离心或过滤分离。缺点：有机溶剂可使某些生物大分子变性失活，操作常需在低温下进行；有机溶剂具有一定毒性。,2022/12/9,66,有机溶剂的选择,选择有机溶剂的原则：有机溶剂的水溶性好；沉淀效率高；毒性小，避免损害工作人员的健康和污染环境；不与溶质分子发生化学反应，价格便宜。使用较多的是乙醇、丙酮、甲醇等。,20

25、22/12/9,67,残留的有机溶剂去除的方法： 自然蒸发或负压蒸发，可在室温进行； 凝胶过滤除去。,（三）离子交换层析法,离子交换层系（ion exchange chromatography， IEC）是利用离子交换剂上可交换离子与组分中的离子发生可逆交换时结合力的差别，而进行分离的一种技术。广泛应用于很多生命物质的分析、制备和纯化等。,优点： 重现性好，简单易行； 分辨力强，回收率高； 具有多孔性，表面积大、交换容量大； 具有亲水性，对大分子的吸附不牢固，层析条件温和，不致引起物质变性或失活。,2022/12/9,69,离子交换法的固定相是离子交换剂；若担体带有正电荷，可吸附着负电荷分子，

26、则为阴离子交换法；不带净电荷的分子，以及阳离子则直接流出，不会被吸附上去。这些被固相单体所吸附的离子，统称为 counter ion，因为其电荷与担体上的电荷相反 (counter 是 相反 的意思),离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。它可分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。,基本原理,2022/12/9,70,阳离子交换反应：R-A- H+ + Y+ R-A- X+ + H+ 阴离子交换反应：R-B+ OH- + X- R-B+ X- + OH- R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，A-

27、和B+分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，H+ 和OH-分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，Y+ 和X-分别代表溶液中的离子基团。,2022/12/9,71,离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂的玻璃管（1.5 cm15 cm）中进行的。,含有预被分离的离子的溶液通过离子交换柱时，各种离子即与离子交换剂上的荷电部位竞争结合。任何离子通过柱时的移动速率取决于与离子交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度。,2022/12/9,72,2022/12/9,73,两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要

28、取决于它们的理化性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。大多数蛋白在生理pH（pH68）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活，应尽量避免。 洗脱可采用改变溶液的pH或离子强度，也可同时改变pH与离子强度的方法。改变pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱。用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。,2022/12/9,74,表3-8 在阴离子交换柱上血浆蛋白组分的分段洗脱,2022/12/9,75,三、技术要点,（一）离子交换剂的选择和处理两性离子如蛋

29、白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。大多数蛋白在生理pH（pH68）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活，应尽量避免。处理的目的：使交换剂充分溶胀，使其颗粒的孔隙增大，让具有交换活性的电荷基团充分暴露出来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需要的反离子。 （二）装柱和加样选择平衡缓冲液的离子强度和pH时，首先要保证待分离物质的稳定；其次是使离子交换剂与待分离物质有适当的结合，而不与样品中杂质结合，以达到分离的目的。溶液的离子强度常用不影响蛋白质吸附到交换剂上的最高离子强度液，常用的离子强度为20 mmol

30、/L 50 mmol/L NaCl。（三）洗脱和收集洗脱可采用改变溶液的pH或离子强度，也可同时改变pH与离子强度的方法。改变pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱。用一定盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。（四）离子交换剂的再生与保存使其带上所需的平衡离子。,2022/12/9,76,（四）亲和层析法,亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性的一种高度专一的吸附层析类型。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。配体本身必须有两个基团： 一

31、个能与载体共价结合，连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变 一个能与被亲和分子结合。,2022/12/9,77,亲和层析法有点像在钓鱼，鱼是我们所要的分子 (B) 杂夹在一堆蛋白质当中，鱼饵是与 B 具有专一性的分子 (A, 上图 1)；A 与 B 的专一性很高，只会在样本中与 B 结合，而排除其它杂质 (上图 2)；若把结合在吸着剂上的 B 溶离下来，就可以得到均质的 B (上图 3)。,2022/12/9,78,2022/12/9,79,表3-16 亲和层析中部分蛋白配体,3、特异性抗体的筛选与效价测定,抗体的效价又称滴度，指某一物质与一定容量的另一物质产生反应所需要的量。免疫分析中，免疫

32、血清中抗体的效价指将血清稀释，测定与一定的抗原能发生反应的最大稀释度，此最大稀释度即为血清的效价。常用的效价测定方法有免疫扩散法、间接血凝法和ELISA法等。特异性抗体的筛选，制备出含不同的抗原决定簇的特异性抗原，然后根据抗体和这些抗原相互作用的强弱进行分析。,一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用,主要内容,四、免疫分析方法及其应用,放射免疫分析法（RIA）荧光免疫分析法（FIA）克隆酶给予体免疫分析法（CEDIA）酶联免疫吸附分析法（ELISA）,放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA）,1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用标记

33、抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标准曲线的测量范围也明显扩大。由于特异性单克隆抗体用于免疫放射分析，使本法得到了更快的发展。近年来，基因工程抗体和抗原应用于本技术，使得免疫放射分析法更加完善。放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类竞争性体外放射分析技术.,基本原理,基本原理：放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原）与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争结合 ,这种竞争可用以下反应式来表示：,抗原 抗体,常用的标记物：125 I和氚标记物放射性活度（贝克，Bp）1Bp：每秒一次

34、核衰变比活度（Bp/g）：每单位质量所含的放射性比活度,游离状态,结合状态,具体步骤,抗原抗体反应,结合的和游离的放射性物质的分离,放射性活度的测定,柱色谱法吸附法沉淀法抗抗体发微孔滤膜法固相法,求出结合率，绘制标准曲线（剂量反应曲线）,荧光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA）,免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和 敏感性与显微示踪的精确性相结合的一项技术以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原,荧光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA）

35、,在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在的部位在实际工作中，由于荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以一般通称为荧光抗体技术,根据实验方法分类,直接法间接法补体法其他,直接法,将荧光标记的特异性抗体（抗原）直接加在抗原（抗体）上，经一定的温度和时间染色，水洗-干燥-封片-镜检操作简便、特异性高、非特异性染色少敏感性低,抗原,标记抗体,荧光,间接法,先用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标记的抗体（二抗）与其反应，形成抗原-抗体-抗体复合物，水洗-干燥-封镜-镜检,未知抗原,未标记抗体,标记抗体,荧光,补体法,利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物

36、发射荧光,补体,标记抗补体抗体,时间分辨荧光免疫测定,利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。,基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） 酶标记的抗原或抗体（标记物） 酶作用的底物（显色剂）,酶联免疫吸附分析法（ELISA）,双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。 它是检测抗原最常用ELI

37、SA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。,实验原理 双抗体夹心法,酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。1、HRP催化过氧化

38、物的氧化反应。供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波长为492nmTMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm 2、AP为磷酸酯酶 一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应,一、光度酶联免疫分析1、酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面；抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体； 在测定时，使受检标本

39、和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相抗原或固相抗体起反应； 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例； 加入酶反应底物，底物被酶催化为有色产物，产物量与标本中受检物的量相关，用分光光度法进行定量。,2、ELISA的固相载体良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。最常用的是聚苯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。ELISA载体的形式有小试管、小珠和微量反应板。,3、固相载体的包被与封闭（1）包被（coating）指将抗原或抗体连接到固相载体上的过

40、程。以聚苯乙烯微量反应板为例，通常先将抗原或抗体溶于pH 9.6的碳酸盐缓冲液（或pH 7.2的磷酸盐缓冲液，pH 78的Tris-HCl缓冲液）中，加满反应孔，置4过夜，洗涤即可。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为0.120g/ml。,（2）封闭（blocking）指继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。所有的ELISA固相载体均需封闭。常用封闭剂有0.05%0.5% BSA；10%小牛血清或1%明胶；脱脂奶粉，比较价廉

41、，可高浓度使用（5%）。,4、稀释液、洗涤液和酶反应终止液（1）稀释液用于稀释酶标抗体及标本。常用中性PBS或Tris-HCl缓冲液，其中含有无关高浓度蛋白（如10动物血清、1BSA（牛血清白蛋白）、1明胶等）和非离子型表面活性剂（如0.05Tween 20或TritonX-100等）。（2）洗涤液一般与稀释液相同，常用PBS或Tris-HCl缓冲液。四种常用的抗体稀释液和三种常用的洗涤液列于表7-2。,表7-2 常用的抗体稀释液和洗涤液,（3）酶反应终止液 辣根过氧化物酶（HRP）反应终止液为2mol/L4mol/L H2SO4（HRP在酸性条件下丧失酶活性）。很多ELISA试剂采用碱性磷酸

42、酶（AP）作为标记酶，用3mol/L NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。,5、ELISA法常用酶的底物系统ELISA法对底物的要求：价廉易得、安全；显色性和稳定性好；底物本身最好为无色物质；终止酶催化反应后，底物不应再继续地自发性变性；其最终产物可溶、易于测定及光吸收值高。,（1）辣根过氧化物酶的底物系统 常见底物有邻苯二胺（OPD，产物橙红色，测定波长492nm）、5-氨基水杨酸（5-AS，产物橙色，测定波长550nm）、3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB，产物红色，测定波长450nm）、2,2-连氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐）（ABTS）等。ABTS的反应曲线不好。OP

43、D溶液具有光敏性，相对来说不稳定，且具有诱变特性。TMB的背景值低，溶液稳定，没有诱变特性。,（2）碱性磷酸酶的底物系统 常用的底物为对硝基磷酸苯酯（PNP），水解的产物为黄色的对硝基苯酚，可在405nm处检测其吸光度的变化，该底物的转化效率高，线性关系好。用酚酞磷酸酯为底物，水解生成的酚酞在碱性条件下呈红色，可在530nm处光度法测定。此外还可以百里酚酞单磷酸酯等为底物。,（3）-D-半乳糖苷酶的底物系统 常见底物有邻硝基苯-D-半乳糖苷（ONPG），其水解的产物邻硝基苯酚在405nm处具有最大吸光度值。其他的底物有对硝基苯-D-半乳糖苷（PNPG）、苯基-D-半乳糖苷、氯酚红-D-半乳糖苷

44、（CPRG）、9-羟基-3-异吩噁唑酮-D-半乳糖苷（RG）等。（4）青霉素酶（PNC）的底物系统 常用底物有溴麝香草酚蓝（BTB）、青霉酮酸还原淀粉-碘复合物（SIC）、溴甲酚紫（BCP）和溴麝香草酚蓝（21）等。,二、ELISA酶联方法和试验方法1、ELISA酶联方法ELISA酶联方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。（1）戊二醛交联法 戊二醛是一种双功能团试剂，它可以联结具有氨基的酶和蛋白质。戊二醛交联法有一步法、两步法两种。,图7-2 戊二醛一步法反应原理,一步法 将戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。该法操作简便、有效，重复性好。缺点是交联反应是随机的，

45、酶与酶、抗体与抗体之间有可能交联。,图7-3 戊二醛二步法反应原理,两步法 先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体；或先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，有助于本底的改善。,（2）过碘酸盐氧化法 本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶（HRP）的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为活泼的醛基，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。图7-4 过碘酸盐氧化法,2、ELISA试验方法ELISA法中有三个必要试剂：固相抗原或抗体；酶标记抗原或抗体；酶反应底物。根据试剂的来源和标本的

46、性状以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。如双抗体夹心法、间接法、竞争法、异种动物抗体双夹心法、抗酶抗体法、竞争性抑制法、双夹心法和抗原直接包被法等方法。,（1）双抗体夹心法双抗体夹心法（double antibody sandwich，DAS-ELISA）由Clark和Adams于1977年建立，是最经典的ELISA检测法。该法的灵敏度高，特异性强，但提纯免疫球蛋白和制备酶标记物要求技术性强，成本较高。该法只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。,图7-5 双抗体夹心法,（2）间接法间接法（indirect ELISA）是最常用的EL

47、ISA检测方法，其原理是利用酶标记的抗体和已与固相抗原结合的受检抗体相结合。该法只要更换不同的固相抗原，就可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。该方法不必为每个待测抗体（或抗原）制备特异性的酶标抗抗体（或酶标抗体），极大地简化了实验。,图7-6 间接法,（3）竞争法竞争法（competing ELISA）是利用待测抗原和酶标抗原与特异性抗体竞争结合，或待测抗体和酶标抗体与特异性抗原竞争结合而进行测定的一种方法（图7-7）。,图7-7 竞争法,（4）异种动物抗体双夹心法异种动物抗体双夹心法（图7-8），又称间接双抗体夹心法（indirect DAS-ELISA）或三抗体夹心法（tripl

48、e antibodies sandwich，TAS-ELISA）。此法可用通用的酶标记抗体检验多种病毒，它不仅免去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。,图7-8 异种动物抗体夹心法,（5）抗酶抗体法抗酶抗体法（图7-9）是利用免疫学反应而不是用化学交联反应来制备酶结合物，常用HRP为标记酶作为抗原免疫动物制备抗HRP抗体。可用一种动物（如兔）制备特异性抗体（第一抗体）和抗酶抗体（第三抗体），再用另一种动物（如羊）制备抗第一种动物（兔）IgG的抗体（第二抗体）。让这种抗IgG的第二抗体把第一抗体（兔IgG）和抗酶抗体（也为兔IgG）通过免疫学反应连接起来。最后让酶与抗酶抗体结合，通过对底物的作用

49、而揭示在固相载体上待测抗原的存在。,优点:HRP通过免疫学反应与抗体结合，避免了用化学方法交联时抗体活性的改变，也避免了HRP与其他蛋白质分子结合，防止标记抗体和游离的未标记抗体之间的竞争，提高了标记抗体的质量。在纯化化学交联反应制备的酶结合物的过程中，除去未标记抗体比较困难，而且该法仅在制备抗酶抗体时用少量纯HRP作抗原，所以用较粗制的HRP与抗酶抗体形成免疫复合物，并不影响其质量，这大大节约了价格较昂贵的精制HRP。因为制备抗酶抗体必须在动物中进行，故抗酶抗体法多适用于检测动物中的抗体。,图7-9 抗酶抗体法,三、ELISA反应条件的选择1、酶标抗体浓度的选择先用200L IgG（100

50、mg/ml）包被小孔，再将酶标记抗体球蛋白系列稀释并加入小孔中，洗涤后，加底物反应，终止后测定吸光度。选择吸光度为1的稀释度作为酶标抗体最适浓度。,图7-10 酶标抗体浓度的选择,2、包被浓度的选择当包被抗原的浓度较低时，包被量随抗原浓度的增加而增大；当包被抗原达到一定浓度后，包被量为定值，不再随抗原浓度的增加而增大。此浓度称为抗原的饱和包被浓度。,图7-11 抗原包被量和ELISA反应的关系,表7-3 SM-EDA-GA包被法中链霉素包被质量浓度对ELISA实验误差的影响,3、酶-底物反应时间的选择抗原与抗体、抗体与酶标抗体反应一般在37反应23h达到高峰。时间太短，敏感性下降，时间太长，吸