激光共聚焦使用手册讲解课件.ppt

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1、激光共聚焦显微镜FV1000- 光谱扫描型 -(倒置显微镜IX81)简易使用说明书,启动系统3显微镜镜下观察微分干涉差观察 4荧光观察 5取图的操作界面 6如何取图XY平面单标 7XY平面双标同步扫描方式 10序列扫描方式 13XY平面单标 + 微分干涉差16XYZ扫描双标 19XYL光谱扫描 212D 操作界面 24图像分析打开文件 243D图像的叠加 25比例尺的使用 263D图像的重建 273D图像的旋转 29Unmixing31保存图像 35保存到CD-R36关闭系统37附录 38,内容,1. 打开计算机.2. 打开激光器.(打开钥匙开关.)2-1.多线氩离子 (458 nm, 488

2、 nm, 514 nm) ON(打开电源开关后,打开钥匙开关.)2-2.氦氖绿 (543 nm) ON2-3.氦氖红 (633 nm) ON打开汞灯电源开关.登陆 Windows XP系统.双击快捷方式： 打开 FV10-ASW应用软件.* 系统软件的启动需要等待一定时间.,开启系统,5,2,3,1,User ID:AdministratorPassword:fluoview,User ID:AdministratorPassword:Administrator, 微分干涉差观察 ,1.使用手控面板选择物镜. (参照 Memo.)2.插入起偏镜.3.插入微分干涉滑块.4.点击FV10-ASW软

3、件中的图标.5.标本聚焦.,Memo按照7-1的操作转换物镜的倍率之后，对：物镜各物镜对应的DIC元件*进行操作.,*DIC 元件,1,2,3,4,Note 1.使用TD滑块控制卤素灯的光强.Note 2.检查滤色片转盘的位置是否为“6.DICT” .如果不是,用手柄按下DICT图标.,Note 1,显微镜镜下观察,手控面板,用此旋钮进行微分干涉法对比度的调节., 荧光观察 ,1,2,3,显微镜镜下观察,Hand switch,1.使用手控面板选择物镜.2.点击FV10-ASW软件中的图标.3.使用手控面板选择荧光滤色片. (参照 Memo.)4.标本聚焦.,Note 2,Notes 1 &

4、3,Note 1.选择第3步后,显微镜进入荧光观察状态. 注意此时汞灯的机械快门要打开. (建议通常机械快门要放在关闭的位置 () .)Note 2.检查DIC滑块是否拉出.,Memo关于荧光滤色片NIBA：蓝色激发/绿色荧光（例：FITC、EGFP等）WIG ：绿色激发/红色荧光（例：Rhodamine、DsRed等）,Note 3.观察之前，检查汞灯的机械快门要放在开启的位置 ().,图像的拇指索引,明场观察 (显微镜镜下观察),荧光观察 (显微镜镜下观察),染料选择,光路图,取图条件的保存,调出取图条件,TwinScanner 设定,取图的操作界面,扫描的按钮选择XYZ,XYT或XYL每

5、个通道的调节 共聚焦的孔径大小卤素灯的光强调节 Kalman方式,图像显示窗口,内存中所显示的文件,扫描模式扫描速度像素数缩放和平移 激光输出的调节,Lambda扫描的设定物镜聚焦时间间隔和时间计数(用于XYT或XT扫描),扫描带宽选择,获取单张图像（XY平面）（荧光图像）例：绿色荧光染色（FITC）,点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2.3. 点击Apply按钮.(关闭染料选择面板可以用Close按钮.),

6、1,2,3,染料选择后的显示界面,如何取图 (XY平面-单标),Memo扫描控制面板:连续扫描:停止扫描:快速扫描(隔行扫描),4,5,6,如何取图 (XY平面-单标),4.点击XY Repeat按钮开始扫描.5.调节绿色(FITC)图像.(图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1.)6.点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo.),7,8,9,10,如何取图 (XY平面-单标),7.选择AutoHV, 并选择扫描速度.*随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 8.点击XY按

7、钮取得一幅图像.9.点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现.10.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.),MemoFV10-ASW专用的图形格式OIF格式:创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.OIB格式:创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作.,1,2,3,获取单张图像（XY平面）（荧光图像） 例：绿色荧光（ Alexa 488 ）红色荧光（ Alexa 546 ）二重染色同步

8、扫描,如何取图 (XY平面-双标),点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2.3. 点击Apply按钮.(关闭染料选择面板可以用Close按钮.),染料选择后的显示界面,4,5,6,如何取图 (XY平面-双标),Memo扫描控制面板:连续扫描:停止扫描:快速扫描(隔行扫描),4.点击XY Repeat按钮开始扫描.5.调节绿色(Alexa Fluor 488)图像和红色 (Alexa Fluor 546)图像.

9、(图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1.)6.点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo.),7,8,9,10,如何取图 (XY平面-双标),7.选择AutoHV, 并选择扫描速度.*随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 8.点击XY按钮取得一幅图像.9.点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现.10.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用

10、的图像格式.),MemoFV10-ASW专用的图形格式OIF格式:创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.OIB格式:创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作.,1,2,3,获取单张图像（XY平面）（荧光图像） 例：绿色荧光（ Alexa 488 ）红色荧光（ Alexa 546 ）二重染色序列扫描 (这里介绍线序列扫描.),如何取图 (XY平面-双标),点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外

11、荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2.3. 点击Apply按钮.(关闭染料选择面板可以用Close按钮.),染料选择后的显示界面,4,5,6,7,如何取图 (XY平面-双标),4.点击序列扫描,并选择线序列方式.5.点击XY Repeat按钮开始扫描.6.调节绿色(Alexa Fluor 488)图像和红色 (Alexa Fluor 546)图像. (图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1.)7.点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo.),8,9,10,11,如何取图 (XY平面-双标),8.选择AutoHV, 并选择扫描速度.*随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提

12、下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 9.点击XY按钮取得一幅图像.10.点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现.11.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.),MemoFV10-ASW专用的图形格式OIF格式:创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.OIB格式:创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作.,1,2,

13、3,4,获取单张图像（XY平面）（荧光图像微分干涉） 例：绿色荧光（FITC）+DIC图像,如何取图 (XY平面-单标+微分干涉差),1. 点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2.3. 点击Apply按钮. (关闭染料选择面板可以用Close按钮.)4. 选择TD1.,染料选择后的显示界面,5,6,7,如何取图 (XY平面-单标+微分干涉差),Memo扫描控制面板:连续扫描:停止扫描:快速扫描(隔行扫描),5.

14、点击XY Repeat按钮开始扫描. 6.调节绿色 (FITC)图像和微分干涉差的图像.(图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1.)7.点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo.),8,9,10,11,如何取图 (XY平面-单标+微分干涉差),8. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.*随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 9.点击XY按钮取得一幅图像.10.点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现.11.保存该幅图像:

15、右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.),MemoFV10-ASW专用的图形格式OIF格式:创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.OIB格式:创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作.,1,4,5,8,Memo 和 按钮: 点击移动1.0m.: 点击移动0.1m.,2,6,7, 获取3D图像(XYZ) (荧光图像) 例: 绿色荧光(FITC)和红色荧光 (Rhodamine)双标这里介绍线序列扫描取图的过程.,如何取图 (XYZ扫描-双标),1.采用

16、13和14页步骤1到7.2.输入StepSize大小(点击OP按钮可以使用推荐的值), 并选择 .3.点击XY Repeat按钮开始扫描.4.点击 和 按钮上移焦点位置. (参照Memo.)5.当图像显示到达上限时, 点击Set 按钮确定.6.点击 和 按钮下移焦点位置. (参照Memo.)7.当图像显示到达下限时, 点击Set 按钮确定.8.点击Stop按钮停止扫描.,确定Z轴的上限和下限如下.,9,10,11,13,12,如何取图 (XYZ扫描-双标),9.选择AutoHV, 并选择扫描速度.*随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman acc

17、umulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 10.选择Depth按钮.11.点击XYZ按钮取得图像.12.点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现.13.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.),MemoFV10-ASW专用的图形格式OIF格式:创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.OIB格式:创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作.,1,2,3,*可以通过调用扫描状态来实

18、现该设置. 更多的信息, 参照附录5., 获取光谱图像 (XYL) 例: 绿色荧光(Alexa Fluor 488)和绿色荧光 (YOYO-1)双标,如何取图 (XYL光谱扫描),1. 点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 2. 点击按钮 检查光路.3. 做如下设置.,选择 BS20/80 或 DM405/488.,选择488nm作为激发光源.,选择 Mirror.,只选择CHS1.,4,5,6,7,9,如何取图 (XYL光谱扫描),4.点击按钮 , 出现光谱设置窗口.5.设置CHS1光谱带宽为10 nm, 以此 为例.(参照附录4关于改变光谱

19、带宽的方法.) 6.点击XY Repeat按钮开始扫描.7.在观察图像的同时, 移动光谱带到图像最亮的位置状态.(参照附录4关于改变光谱带宽的方法.)注:移动光谱带位置要保持光谱 带宽为10 nm不变.8.调节图像.(参照附录1.) 9.点击Stop按钮停止扫描.,10,11,12,13,15,14,如何取图 (XYL光谱扫描),10.选择AutoHV, 并选择扫描速度.*随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 11.设定要扫描的波长范围, 光谱带宽 和步距.Start = 开始波长E

20、nd = 结束波长Resolution = 光谱带宽StepSize = 步距12.选择Lambda按钮.13.点击XYL按钮取得图像.14.点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现.15.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“oib” 和oif类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.),1.双击资源管理器中要选择打开的文件.,1,图像分析(打开文件),2D的操作界面,1,2,图像分析 (3D图像的叠加),1.点击按钮 并选择 .,2.要保存此图像, 右击此图像, 选择Save Display并命

21、名.,1,2,3,4,5,图像分析 (比例尺的使用),1.点击按钮 .2.点击图像的同时, 拖放此比例尺到一个特定的位置.3.点击手柄的左端或右端, 移动鼠标.4.选择比例尺并右击选择属性的设置.5.设置具体的比例尺属性.,改变比例尺的大小,改变文本, 颜色, 字体等.,以一定的角度观察3D图像,观察3D图像的某个横截面,1,3,4,5,图像分析 (3D图像的重建),1.点击按钮 .2.创建3D图像.3.拖动鼠标以一定的角度观察图像.要保存此图像, 进行下一页第6步的 操作.,4.点击按钮 并选定 .5.拖动鼠标观察某个垂直横断面.要保存此图像, 进行下一页第6步的 操作.,保存上一页中第3、

22、5选项的图像,6,8,图像分析 (3D图像的重建),6.点击按钮 .7.会创建一个2D图像 (带文件名).8.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.),MemoFV10-ASW专用的图形格式OIF格式:创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.OIB格式:创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作.,1,3,动画的播放,4,图像分析 (3D图像的旋转),1.点击按钮 .2.创建3D图像.3.拖动鼠标以一定的角度观察图像.,4.点击并控制按钮

23、实现图像围绕着 X-轴旋转.再次点击停止旋转.点击并控制按钮 实现图像围绕着 Y-轴旋转.再次点击停止旋转.点击并控制按钮 实现图像围绕着 Z-轴旋转.再次点击停止旋转.,5,7,10,6,8,9,图像分析 (3D图像的旋转),5.点击按钮 .6.点击Angle rotation菜单.7.选择旋转轴.8.输入旋转的角度.9.选择AVI类型并点击Create按钮. 10.输入一个文件名并点击Save按钮.,Start =开始角度End =结束角度Frame/s =旋转速度Interval =单次旋转的角度,2,3,4,图像分析 (Unmixing)I. 每种荧光染料的定位都很明显的情形,基于XY

24、L图像中类似荧光光谱相连的原则, 通过已知的每种荧光染料的定位分解光谱并得到图像.,例:绿色荧光(Alexa Fluor 488)和绿色荧光 (YOYO-1)双标,5,6,Unmixed image,1.打开一幅 Alexa Fluor 488和 YOYO1双标的XYL图像.2.分别为 Alexa Fluor 488和 YOYO1选定一个封闭的区域.3.从Processing下拉菜单中选择 Spectral Deconvolution图标.4.双击ROI1和ROI2区域.5.检查处理类型设置为 “Normal”并且 点击Execute按钮.6.获得图像.,2,3,4,5,6,记载的荧光光谱在此

25、显示.,图像分析 (Unmixing)II. 基于使用单标样品作参照的情形,从单标记的XYL图像中取出单个荧光光谱作为参照, 进行光谱的分解并得到图像.,例:绿色荧光(Alexa Fluor 488)和绿色荧光 (YOYO-1)双标,1.打开一幅 Alexa Fluor 488单标取样 的XYL图像.2.为 Alexa Fluor 488选定一个封闭的 区域.3.从Processing下拉菜单中选择 Spectral Deconvolution图标.4.双击ROI1区域.5.点击Save Profile图标.6.输入保存的名字并且点击OK按钮将 Alexa Fluor 488的光谱记载到数据库

26、中.7.对于YOYO1单标, 重复1-6步.,Unmixed image,9,10,11,12,8,图像分析 (Unmixing)II. 基于使用单标样品作参照的情形,8.打开一幅 Alexa Fluor 488和 YOYO1双标的XYL图像.9.从Processing下拉菜单中选择 Spectral Deconvolution图标.10.双击数据库中记载的 Alexa Fluor 488 和 YOYO1图标.11.检查处理类型设置为 “Normal”并且 点击Execute按钮.12.获得图像.,2,3,4,5,图像分析 (Unmixing)III.基于只知道一定数量标记的荧光染料的情形 (

27、Blind Unmixing),基于XYL图像中类似荧光光谱相连的原则, 通过已知的一定数量的荧光标记分解光谱并得到图像.,例: 两种类型荧光标记的样品,Unmixed image,1.打开一幅具有两种类型荧光标记的XYL图像.2.从Processing下拉菜单中选择 Spectral Deconvolution图标.3.选中两个检查框用于计算.(具有三种类型荧光标记时要选中 三个检查框.)4.检查处理类型设置为 “Blind”并且 点击Execute按钮.5.获得图像.,XY或者XYZ图像的每个通道存为 TIFF格式的文件,1.右击图像管理器中显示的图像图标, 选择另存为保存该幅图像.2.设

28、置Save as类型为 TIFF并保存.* 存为BMP 和 JPEG格式也可以.,1,2,3,1,2,图像分析 (保存图像),*,XY或者XYZ通道合并的图像存为 TIFF格式的文件,带有比例尺的图像存为BMP格式的文件,1.右击图像管理器中显示的图像图标, 选择另存为保存该幅图像.2.设置Save as类型为 TIFF并保存.3.检查要合并的通道并保存.* 存为BMP 和 JPEG格式也可以.,1.右击该幅图像.2.选择Save Display并以新的文件名 保存该幅图像.,动态图像存为AVI格式的文件,1.右击该图像.2.选择Save as AVI并以新的文件名 保存该图像.,保存到 CD

29、-R,2,3,4,5,7,6,1.插入一张CD-R光盘.2.点击OK.3.选择文件并拖放到CD-R的窗口.4.点击Write these files to CD.5.点击Next.6.开始刻录.7.点击Finish按钮结束.,1,3,4,关闭系统,2,1.选择File/Exit, 退出FV10-ASW软件.2.退出Windows XP.(1)选择Start/Shut Down. (2)在Shut Down窗口中,选择Shut Down并点击OK按钮.3.关闭激光器.(关闭钥匙开关.)3-1.多线氩离子 (458 nm, 488 nm, 514 nm) OFF (等待风扇停止,关闭电源开关.)3

30、-2.氦氖绿 (543 nm) OFF3-3.氦氖红 (633 nm) OFF4.关闭汞灯电源.,激光共聚焦显微镜FV1000- 光谱扫描型 -(倒置显微镜IX81)附录, 共聚焦的原理和调节原理,附录1,HV: 探测器灵敏度的调节 (Voltage)给定值 灵敏度 图像亮度 (注意背景噪音变得突出.)* 推荐值为700V或700V以下. 按钮: 改变电压以1V为一个单位 (投射光通道设定为1V)Gain调节 (x)给定值 图像亮度 依照放大率的变化, 图像变得更亮. 按钮: 改变增益以x 0.01为一个单位 Offset调节 (%)给定值 图像亮度 按钮: 改变增益补偿以1%为一个单位,C.

31、A.: 共聚焦孔径大小的调节 (m)给定值 C.A. 大小 图像亮度 (注意光学切片的厚度变大.)*推荐使用Auto设置.经过调节C.A.要恢复初始值, 再次点击Auto. 按钮: 改变孔径大小以1m为一个单位.,M_Ar or HeNeG, HeNeR:激光输出强度的调节 (%)给定值 输出强度 图像亮度 (注意荧光漂白变得明显.)*激光输出强度尽量要小. 按钮: 改变输出强度以1%为一个单位., 获取图像如何降低背景噪音 ,降低扫描速度,通过降低扫描速度探测器从开始检测就 忽略背景噪音.优点:相比Kalman方式, 能够取到更锐的图.缺点:单次扫描的速度很慢.,1.选择扫描速度.,附录2,*,Auto ON:扫描速度变慢时, 背景噪音被去除而图像亮度不变.Auto OFF:扫描速度变慢时, 背景噪音被去除而图像亮度增加.,Kalman方式,通过重复获取一定数量的图像进行平均算法运算处理. 从而去除背景噪音和粗糙度.优点:单次扫描的速度很快.缺点:由于图像平均而图像模糊.,1.点击Kalman并选择Line或Frame方式.2.输入累计数字(扫描的次数).,