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1、,Loading,人血清白蛋白的提取纯化与分子量的测定,1,2,3,4,5,6,目录,Contents,实验目的及意义,The experimental purpose and meaning,掌握血清白蛋白分离纯化的方法；学会用盐析和离子交换柱层析法分离纯化蛋白质的原理与操作；掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理和方法。,实验原理,The experimental principles,.血清白蛋白的初步分离在半饱和硫酸铵溶液中，血清白蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后白蛋白主要在上清液中。由于血清白蛋白的相对分子质量较硫酸铵大得多，故盐析初步分离的白蛋白可用透析法或凝胶层析法除去
2、硫酸铵。奈氏试剂是络盐K2HgI4加KOH的溶液，在无机化学定性分析中，用其检验氨或铵盐,血清白蛋白血清白蛋白约占血浆蛋白总量的60%，水溶性很强，结构稳定，能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持血液的正常渗透压作用。此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临床及生物领域应用广泛。可以根据不同蛋白质的相对分子质量、溶解度以及在一定条件下带电的情况的不同来分离及提纯各种蛋白质。盐析广泛使用的分离蛋白质的方法，所谓的盐析就是用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺及所带的电荷被中和，因而破坏
3、了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。但中性盐并不会使蛋白质变性，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就可以重新溶解。,.血清白蛋白的纯化：DEAE纤维素阴离子交换剂离子交换层析是一种用离子交换树脂作支持剂的层析方法。本实验采用的是DEAE纤维素阴离子交换剂（中强碱型），可电离基团是二乙基氨基乙基，适用于大分子的分离。在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH与盐离子浓度有关。因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度和pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。除硫酸铵后的白蛋白溶液在0.02mo
4、l/L pH7.4 醋酸铵缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）一纤维素层析柱上，在此pH 时，DEAE 一纤维素带有正电荷，它能吸附带负电荷的白蛋白、及球蛋白（血清白蛋白等电点为4.5，绝大多数，及球蛋白等电点均小于6 ）。随着盐离子浓度的提高，离子交换柱上的球蛋白、球蛋白、白蛋白依次被洗脱下来。,.血清白蛋白相对分子量的测定：SDSPAGE法SDSPAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白
5、质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性；2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。SDS-蛋白质复合物的特点：1. 由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异；2.复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。,.血清白蛋白相对分子量的测定：SDSPAGE法在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bx（MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数）若将已知分子量的标准蛋白质
6、的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。该法测定蛋白质分子量的局限性：1.蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。2. 电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）。3.结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）。4.带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）。,实验步骤,The experimental steps,血清白蛋白的初步分离血清白蛋白的纯化血清白蛋白相对分子量的测定,血清白蛋白的初步分离,1. 取样取2ml血液，4，3000rpm离心15mi
7、n，移取上清液（血清）1ml至10ml离心管。2. 盐析量取9ml50%的饱和硫酸铵溶液，以移液管逐滴加入，同时不断振荡，4静置2h。4，3000rpm离心15min，收集上清液。用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5（即白蛋白的等电点），用量筒确定上清液的体积，确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH4.5）的体积（0.11V）。逐滴加入饱和硫酸铵（pH4.5），边加边振荡，4 静置2 h。4 ，3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 ml pH 7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液溶解。,血清白蛋白的初步分离,3. 透析将剩余的0.4 ml蛋白质溶液将透析袋中，放入pH
8、7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4存在。NH4的检测（奈氏试剂检测）：取1 ml透析液，加入5滴奈氏试剂，混匀，观察，如果出现砖红色沉淀，说明仍有NH4存在，需继续透析。,血清白蛋白的纯化离子交换层析,装柱：将层析柱固定，保持垂直位。将浸胀的DEAE-纤维素装入柱内，至8-10cm高度，平衡过夜（装柱时应注意均匀，凝胶内不得有气泡，凝胶床要平整）。准备50-100支试管，置于自动收集器上；洗脱液经核酸蛋白检测仪监视，调节流速为 1mL/min，蛋白质检测器调零。上样：将透析袋剪开，用移液管转至凝胶面上，待样品进入凝胶后再加入少量缓冲液，使样品完全进入胶内
9、。洗脱：采用连续梯度洗脱。接上恒流泵，用0.021.0molL醋酸醋酸铵缓冲液（pH7.4）进行梯度洗脱，收集；记录出现峰值的管号；保存样品。,a. 分离胶的制备,在一个干净的小烧杯中，按所列的试剂用量配制。SDS-不连续系统12分离胶浓度，5ml体积配制量 ：,血清白蛋白相对分子量的测定,b. 浓缩胶的制备,在另一个干净的小烧杯中。4.5分离胶浓度，2.5 ml体积配制用量表：,血清白蛋白相对分子量的测定,血清白蛋白相对分子量的测定,c. 样品的处理：向标准蛋白质或待测样品中按比例加入上样缓冲液（Loading dye），充分溶解后，加盖（不要密闭），置沸水浴3 min，取出冷至室温。加样示
10、意图：,以微量注射器或移液枪加入10-20ul至样品槽内。,d. 电泳：点样端负极，恒压：开始80V，待样品进入分离胶后改为100V进行电泳，待蓝色染料迁移至下端约1cm时，停止电泳，约需12小时。（电极缓冲液：pH 8.3 Tris Gly）e. 染色：剥胶后加入考马斯亮兰R-250，染色20min。f. 脱色：染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。2030min换一次脱色液，23次后可初步观察电泳条带，然后脱色过夜，直至背景清晰。,血清白蛋白相对分子量的测定,g. 计算通常以相对迁移率(mr)来表示迁移率。相对迁移率的计算方法如下：用直尺分别量出样品区带中心及染料与凝胶顶端的距离，按下式计算：
11、 相对迁移率(mr) = 样品迁移距离(cm)染料迁移距离(cm)。 以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量,血清白蛋白相对分子量的测定,预计实验结果,The expected experimental results,确定电泳取样的试管编号,可以根据标准蛋白相对分子质量对数及相对迁移率做出标准曲线，以相对迁移率为横轴，以标准蛋白相对分子质量对数为纵轴，预测应为一条直线。,标准蛋白相对分子质量对数及相对迁移率做出的标准曲线,电泳预期效果,可能结果偏差及解释,Possible result bias and inte
12、rpretation,测得的人血清白蛋白分子量偏大测得的人血清白蛋白分子量偏小,蛋白质的磷酸化凝胶浓度不合适，蛋白质跑不动表达的蛋白质提前终止了或者降解SDS变性目的蛋白质不完全，使得蛋白质的空间结构没有成为线型，构成了空间位阻离子交换柱分离效果不好，杂质导致电泳条带过宽，影响结果分析,为什么结果会偏大？,人血清白蛋白是由3个结构相似的-螺旋结构域组成的，它们在SDS等的作用下，可能解离成亚基或单条肽链。因此，SDS-凝胶电泳测定的不是完整分子的分子量。实验过程中对白蛋白造成了机械损伤，使单链多肽链断裂。需通过电泳是否产生拖带等现象判断。,为什么结果会偏小？,实验重点与难点剖析,The key
13、 points and difficult points,对盐析、离子交换层析及SDS-PAGE法的理解；实际操作中对实验条件（pH、时间、加样量等）的控制；后期对数据的处理与对实验结果的分析,可能出现的问题！,1、层析过快，接取样品纯度不够高；2、上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1%-5%；3、洗脱液体积不足，导致分离的各峰太过拥挤。,1、制胶不理想：浓缩胶长度不够，可能导致条带过粗，分离胶浓度过大会有拖尾现象；2、两板之间有气泡：条带两边向下，中间鼓起；3、电极不平衡：条带偏斜；4、加样过多：条带两边扩散。,盐析过程中温度和pH的控制不当，可能使得所得目标产物白蛋白量较少，影响后续测定。,离子交换层析,SDS-PAGE法,盐析,THANKS！,
