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1、培养基灭菌医学知识,培养基灭菌医学知识,一、消毒与灭菌的区别：所谓灭菌就是杀死一切微生物，包括微生物的营养体和芽孢。消毒是指消灭一切致病微生物（病原体）。 二、消毒与灭菌在发酵工业中的应用牛奶巴氏消毒法：80-95，10min发酵培养基的灭菌:121,20min,培养基灭菌医学知识,2,一、消毒与灭菌的区别：培养基灭菌医学知识2,三、灭菌方法：1、干热灭菌：灼烧灭菌；加热方式有电热、红外线加热等；相对与湿热灭菌，干热要求时间长，温度高（一般160，2hr） 1）火焰焚烧法：接种环、试管口等2）干烤法：利用热空气灭菌 用法：160,2小时 特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死。所
2、以温度高、时间长。,培养基灭菌医学知识,3,三、灭菌方法：培养基灭菌医学知识3,2、湿热灭菌：蒸气释放热量，使微生物蛋白质变性。特点：温度低、时间短、灭菌效果好原因： 1) 菌体内含水量越高，则凝固温度越低； 2) 蒸汽冷凝会放出潜热； 3) 饱和水蒸汽穿透力强； 4) 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。,培养基灭菌医学知识,4,2、湿热灭菌：蒸气释放热量，使微生物蛋白质变性。培养基灭菌医,湿热灭菌优点：1）蒸气来源易，低价无毒；2）蒸气穿透力强灭菌彻底；3）蒸气冷凝释放热量；4）蒸气易输送，易调节，易管理。湿热灭菌缺点： 1）设备费用高；2）不能用于怕受潮的物料；,培
3、养基灭菌医学知识,5,湿热灭菌优点：培养基灭菌医学知识5,3、射线灭菌法： 1）电离辐射：、射线 。 原理 ：引起水和其他物质的电离，产生游离基，破坏DNA，从而造成细胞损伤。 特点；穿透力强，无专一性，对所有生物均有杀伤作用。 适用：菌种诱变。,培养基灭菌医学知识,6,3、射线灭菌法：培养基灭菌医学知识6,2）非电离辐射（紫外线）方法：在波长265-266nm处，杀菌力最强。原理：（1）作用于DNA ，使同链DNA相邻嘧啶间形成嘧啶二聚体，引起DNA结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成菌的变异或死亡。（光复活酶可修复）（2）有氧时产生过氧化氢，强氧化杀菌。适用：空气、水的消毒杀菌（紫外灯）
4、。特点：穿透力差。,培养基灭菌医学知识,7,2）非电离辐射（紫外线）培养基灭菌医学知识7,3.过滤灭菌法,采用介质过滤的方法阻截微生物达到除菌的目的 主要用于空气灭菌,培养基灭菌医学知识,8,3.过滤灭菌法 采用介质过滤的方法阻截微生物达到除菌的,4、化学药品灭菌,方法：浸泡、熏蒸、喷洒、擦拭等，常用化学药品：1）表面消毒剂：（1）酚类： 石炭酸（苯酚），0.1%抑菌；1%杀菌 甲酚皂（甲酚+肥皂）：3-5%皮肤消毒 机理：作为表面活性剂，使膜损伤；蛋白质变性 P.C.（石炭酸系数）：为消毒剂杀菌效率的标准。是在一定时间内（10min）被测试的药剂能杀死全部供试微生物的最高稀释度与达到同样效果
5、的酚最高稀释度的比值。,培养基灭菌医学知识,9,4、化学药品灭菌方法：浸泡、熏蒸、喷洒、擦拭等，常用化学药品,（2）醇类：乙醇：70-75%杀菌效率最高机理：具脱水作用，能穿透菌体进入蛋白质分子肽链间隙，使蛋白质变性或脱水沉淀，造成微生物死亡。无水乙醇：表面蛋白凝固，保护膜，杀菌力差甲醇可使眼睛失明，故不宜做消毒剂；其他醇因不溶于水，一般不用。,培养基灭菌医学知识,10,（2）醇类：培养基灭菌医学知识10,（3）醛类：甲醛： 机理：蛋白质烷化剂； 应用：福尔马林（40%）； 10%的甲醛熏蒸，用于空气灭菌。（4）表面活性剂： 可降低表面张力效应的物质。机理：使菌体细胞膜破损；使菌体蛋白质变性。
6、种类：洗必泰、新洁尔灭等特点：快速、彻底、效率高,培养基灭菌医学知识,11,（3）醛类：培养基灭菌医学知识11,（5）氧化剂类：机理：破坏蛋白质的巯基，强氧化剂可破坏蛋白质的氨基与酚羟基碘酒 7g I：5g KI，溶于100ml 95%乙醇。 1%碘酒10min可杀死芽孢杆菌和部分真菌， 并使流感病毒灭活。漂白粉（氯化钙与次氯酸钙的混合物）,培养基灭菌医学知识,12,（5）氧化剂类：培养基灭菌医学知识12,培养基灭菌医学知识培训课件,（7） pH的杀菌作用酸: 蛋白质变性 无机酸:杀菌力与H+浓度成正比。有机酸:与不电离的部分成正比,故有时有机酸的灭菌效果无机酸，分子杀菌力大于离子。碱: 强碱
7、造成蛋白质、核酸大分子变 性、水解，使菌死亡。,培养基灭菌医学知识,14,（7） pH的杀菌作用培养基灭菌医学知识14,2）抗代谢药物,机理：与正常代谢产物同时存在，并产生竞争性拮抗作用（与相应酶竞争性结合）。只有当正常代谢产物的量少或不存在时，抗代谢物才有用。种类：磺胺抑制叶酸合成 6 - 巯基嘌呤抑制嘌呤合成 5 - 甲基色氨酸抑制氨基酸合成机理：磺胺对氨基苯甲酸的类似物，竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，抑制叶酸合成,培养基灭菌医学知识,15,2）抗代谢药物机理：与正常代谢产物同时存在，并产生竞争性拮抗,3）抗生素,（1）抗生素：生物产生的一种次生代谢产物或其衍生物，在低浓度下抑制或影响其他
8、生物的生命活动。 （2）抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，将这一范围称该抗生素的抗菌谱。 广谱：对多种微生物有作用（四环素G+，G-） 窄谱：仅对某一类微生物有作用（青霉素G+） （3）效价：抑菌圈大小，生物活性单位，标准曲线,培养基灭菌医学知识,16,3）抗生素 （1）抗生素：生物产生的一种次生代谢产物或,抗生素作用机理： 1）对细胞壁形成有抑制作用；（如：青霉素） 2）影响细胞膜功能；（如：多粘菌素） 3）抑制蛋白质合成；（如：绿霉素、链霉素） 4）干扰核酸代谢；（如：利福霉素、灰黄霉素）抗药性：变异、适应、进化原因：药物无效；药物被修饰； R质粒（药物抗性基因）,培养基灭菌医学知识,1
9、7,抗生素作用机理：培养基灭菌医学知识17,二、湿热灭菌的原理,1.微生物的热阻：微生物对热的抵抗力；定义：微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力。其对热的抵抗能力越大，可以理解为热阻越大，衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的概念。 相对热阻：两种微生物的热阻之比。 例如：芽孢/大肠杆菌=3000000/1；（表3-1） 病毒/大肠杆菌=15/1致死温度：杀死微生物的极限温度；致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物的时间； 温度越高，致死时间越短。,培养基灭菌医学知识,18,二、湿热灭菌的原理1.微生物的热阻：微生物对热的抵抗力；定,2.微生物的热致死动力学：对数残留定律。
10、 菌体是一个复杂的高分子体系，其受热被杀死，主要的原因是高温能使蛋白质变性，这种反应属于单分子反应（一级反应），因此，杂菌在一定温度下受热死亡的过程可用单分子反应历程加以描述。 -dN/dt = k * N式中dN/dt：表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率 N：表示表示灭菌过程中某瞬间的活菌数 K：表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数,培养基灭菌医学知识,19,2.微生物的热致死动力学：对数残留定律。培养基灭菌医学知识1,上式的积分形式为： t = （2.303/k） lnN0/Nt 式中N0，Nt： 分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个/ml）灭菌时间 t 取决于污染程度N0、灭菌程度
11、Nt 与灭菌速度常数K灭菌程度：对于 Nt ，如果取Nt = 0，那么，t = ，这显然是与现实情况不符。 对于如何Nt取值？通常取Nt= 10-3，即灭菌1000次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。这个数值的取值的大小，也间接反应了该生产过程中的技术管理水平。,培养基灭菌医学知识,20,上式的积分形式为： 培养基灭菌医学知识20,3.热致死反应的速度常数K K是表达微生物耐热性的特征常数，K除了决定于菌体的种类及存在形式外，还是温度的函数（与普通化学反应一样），因此灭菌温度的选择是灭菌操作的核心。K越小，该微生物越耐热，121细菌芽孢K为1min-1,而营养细胞为10-1010min-14
12、、杀灭芽孢的温度和时间不同芽孢耐热性不同,培养条件不同,耐热性也不同。,培养基灭菌医学知识,21,3.热致死反应的速度常数K培养基灭菌医学知识21,5.灭菌温度的选择温度对化学反应的影响特别显著，主要是影响速度常数。灭菌温度的选择应考虑的因素主要有：1）微生物的热致死温度，应高于该温度，通常以芽孢为准。2）高温对营养成分的破坏，灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程，因此，灭菌温度的选择，应是在保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。,培养基灭菌医学知识,22,5.灭菌温度的选择培养基灭菌医学知识22,速度常数与温度之间的关系（阿累尼乌斯公式）： K= Ae-E/RT 式中K：
13、速度常数，1/S E,：活化能（J/mol） R：气体常数，1.987*4.18 J/mol*k T：反应的绝对温度，k上式也可表示为：lgK=-E/2.303RT+lgA 对于某种特定的细菌，活化能E也是一定的，因此，灭菌速度常数的对数lgK与灭菌温度T成反比。,培养基灭菌医学知识,23,速度常数与温度之间的关系（阿累尼乌斯公式）：培养基灭菌医学知,三、影响培养基灭菌的其他因素,温度:致死温度，蛋白质变性灭菌时间：灭菌需维持一段时间才能达到效果培养基成分：保护作用；pH值： pH值6-8，微生物最耐热，表3-4；培养基中的颗粒：颗粒大，灭菌难；泡沫：不利于灭菌。水分含量：水少-温高时长微生物
14、数量的影响：数量多，灭菌时间长,培养基灭菌医学知识,24,三、影响培养基灭菌的其他因素温度:致死温度，蛋白质变性培养基,第二节 灭菌的计算与操作,分批灭菌：分批灭菌操作要点(1)定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：冷却管道，夹套。(2)培养基升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气。(3)培养基升温时开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到100时，停止搅拌，一方面是为了保护轴承，另一方面，当培养基的温度升温到100时，培养基的沸腾，可以起到搅拌作用。,培养基灭菌医学知识,25,第二节 灭菌的计算与操作分批灭菌：分批灭菌操作要点培养基灭菌,(4)注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量罐、流
15、加管道与流加液贮罐，空气流量计等。保温期间温度：118121，时间：30分钟。(5)灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。分批灭菌时间的计算：例3-1连续灭菌时间计算： t = （2.303/k） lnN0/Nt 式中N0、Nt分别为单位体积培养基灭菌前后菌数,培养基灭菌医学知识,26,(4)注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量罐、流加管道与流加,二、培养基连续灭菌计算与操作,连续灭菌又称为连消，即在一套专门灭菌设备中，培养基连续进料、瞬时升温、短时保温、尽快降温的过程。,培养基灭菌医学知识,27,二、培养基连续灭菌计算与操作
16、连续灭菌又称为连消，即在,七、分批灭菌与连续灭菌比较,连续灭菌的优点：1、可采用高温短时，培养基破坏少；2、发酵罐利用率高；3、蒸汽负荷均衡；4、可节约能源；5、劳动强度小。,培养基灭菌医学知识,28,七、分批灭菌与连续灭菌比较连续灭菌的优点：培养基灭菌医学知识,培养基灭菌条件,1、分批灭菌：121，30min，适用于一般培养基、消泡剂等；2、连续灭菌：130 ，5min，也有115 ，6-8min3、其他：如尿素溶液105 ，5min,培养基灭菌医学知识,29,培养基灭菌条件1、分批灭菌：121，30min，适用于一般,思考题,1.培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？灭菌过程符合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。,培养基灭菌医学知识,30,思考题培养基灭菌医学知识30,
