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1、卵巢上皮癌组织中ERCC1基因mRNA表达水平与患者化疗反应性和生存期的关系前言卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌是妇产科最常见的三大恶性肿瘤，随着宫颈癌和子宫内膜癌的早期诊断和治疗已经取得了巨大的进步，卵巢癌已经成为严重威胁女性生命的恶性肿瘤，发现之时多已处于晚期，五年生存率一直在25%30%徘徊1-3。以铂类药物为基础的化学治疗是卵巢癌除手术之外的主要辅助治疗手段，既可用于预防术后的复发，也可用于手术未能全部切除者，部分患者可获暂时缓解，甚至长期存活。然而有20%到30% 的患者对一线化疗药物始终无反应，初治有反应的患者仍有部分会发生继发耐药。研究表明，铂类药物的耐药和核酸切除修复系统（nucle
2、otide excision repair, NER）密切相关，NER系统可以修复铂类化疗药所造成的DNA损伤，从而降低患者对化疗的敏感性4-9。切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementation group 1，ERCC1)是NER系统中的一个关键基因，其表达量与肺癌、胃癌、前列腺癌患者的预后相关。ERCC1基因共10个外显子，可分别转录为两个剪接体，含10个外显子的全长剪接体mRNA (full length, FL),和缺失第VIII外显子（长72bp）的变异剪接体mRNA( alternative splicing, AS)。本研究使用T
3、aqMan实时荧光定量RT-PCR法检测卵巢癌组织中ERCC1的变异剪接体的表达量，以期对此变异剪接的临床意义进行探讨。试验流程1 材料与方法1.1纳入标准：我院自2000年1月至2006年12月所收治的原发性卵巢上皮癌患者，术前未接受化疗，术后经病理确诊。全部标本均经病理科医师切片确诊，病理科医生并不知道病人纳入与排除的情况，充分使用了盲法。术后至少接受3个疗程的以铂类为基础的化疗。术前均签署知情同意书，允许所切除卵巢组织保存于我院并被用于科学研究。1.2 排除标准：接受术前化疗者；卵巢非上皮性癌者；病例资料不完整者；切除卵巢组织未行保存或者保存不善以致无法提取RNA者；拒绝将切除组织用于科
4、研者。符合以上纳入与排除标准者共计63例卵巢上皮癌患者纳入研究。1.3诊断标准：全部标本均经病理科医师切片确诊。组织学分级标准主要依据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）1973年制定的卵巢组织学分类法进行组织学的分类和分级，并参照细胞分化程度分3级：分化1级，为高度分化；分化2级，为中度分化；分化3级，为低度分化。卵巢恶性肿瘤的病理分级、分期根据国际妇产科联盟（Fdration Internationale de Gyncologie et dObsttrique, FIGO）2000年修订的临床分期标准来判断临床期别：卵巢恶性肿瘤的手术-病理分期FIG
5、O TNM0 原发肿瘤无法评价 TX无原发肿瘤证据 T0 肿瘤局限于卵巢 T1a 肿瘤局限于一侧卵巢，包膜完整，表面无肿瘤， T1a腹水或腹腔冲洗液中未查见恶性细胞。b 肿瘤局限于两侧卵巢，包膜完整，表面无肿瘤， T1b腹水或腹腔冲洗液中未查见恶性细胞。c 肿瘤局限于单侧或双侧卵巢，伴有以下任何一项者： T1c包膜破裂、卵巢表面有肿瘤、腹水或冲洗液中有恶性细胞。 肿瘤累及一侧或双侧卵巢，伴盆腔内转移。 T2a 肿瘤蔓延和/或转移到子宫和/或输卵管， T2a腹水或冲洗液中无恶性细胞。b 肿瘤蔓延到盆腔其它组织，腹水或冲洗液中无恶性细胞。 T2bc a 或b病变，但腹水或冲洗液中查见恶性细胞。 T
6、2b 肿瘤侵犯一侧或双侧卵巢，镜检证实盆腔外有腹膜转移 T3和/或N1和/或区域淋巴结转移。a 镜检证实盆腔外腹膜转移超出盆腔外。 T3ab 盆腔外腹膜大块转移灶最大径线2cm T3bc 盆腔外腹膜转移灶最大径线2cm， T3c和/或N1和/或区域淋巴结转移 远处转移（腹膜转移除外） M1注： 肝包膜转移为T3/期，肝实质转移为M1/期。胸膜渗出液必须有阳性细胞才能分为M1/期。N0-无区域淋巴结转移，N1-区域淋巴结转移。M0-无远处转移，M1-远处转移（腹膜转移除外）。1.4 化疗效果判断标准：判断标准参照曾益新主编的肿瘤学第2版第410页，以临床检查，CA-125和影像学检查结果来判断，
7、肿瘤完全消失超过一个月为完全缓解（complete remission, CR）；肿瘤体积缩小超过50%且持续一个月以上为部分缓解（partial remission, PR）；肿瘤体积增大超过50%或有新病灶的出现为进展（progressive, P）；肿瘤体积变化不超过25%为稳定（Stable, S）。对化疗敏感的定义：完全缓解与部分缓解均为敏感，对化疗有反应。对化疗耐药的定义：进展与稳定均为耐药，对化疗无反应。随访：生存时间的计算方法为从接受治疗之初到随访结束或者死亡之时。经门诊随访或者电话和信件随访。1.5主要仪器超速低温离心机 - 德国西门子公司TGL-16C台式高速离心机 - 上
8、海安亭科学仪器厂Gel doc 2000 凝胶成像分析系统 - 美国Bio-Rad公司紫外可见分光光度计 - 北京普析通用仪器有限责任公司普通PCR扩增仪-美国热电公司Thermo electron corporation 电动玻璃匀浆机-宁波玻璃仪器厂 OLYMPUS光学显微镜-日本OLYMPUS公司恒温水浴箱- 国产冰浴加样盒- 国产 桥式水平电泳仪槽 - 北京崇文东方仪器厂 DYY-型稳压稳流电泳仪 - 北京六一仪器厂 Eppendorf管- 国产 各式微量移液器 - 美国Gilson公司 超低温冰箱-中国海尔公司Chromo4 Real-Time PCR Detector实时荧光定量P
9、CR仪-购自美国Bio-rad公司；荧光定量PCR管0.2ml-薄壁美国Cepheid 公司Smartcycler 1.6 主要试剂及配制(1) TRizol 试剂 购自Invitrogen公司(2)First Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录试剂盒 购自MBI Fermentas 公司，内含： M-Mulv 反转录酶 Oligo(dT)18 (0.5g/l)高浓度dNTP 10mM dNTPRNA酶抑制剂Rnasin inhibitor 5reaction buffer(3) Taq PCR Master Mix 购自 TIANGEN生物有限公司 (4)异丙醇、无水
10、乙醇 国药集团化学试剂有限公司(5)焦碳酸二乙酯(DEPC) 上海生物工程公司(6)三氯甲烷（氯仿） 东风化工厂(7)溴化乙锭EtBr 上海生物工程公司(8)琼脂糖 上海捷瑞生物技术公司(9) 50TAE BIOWEST AGAROSE公司(10) 50bp Ladder DNA Marker 购自 大连宝生物公司1.6.1 主要试剂的配制(1) 0.1%DEPC水配制0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）是RNA酶的强烈抑制剂，所有接触RNA的器具均需经过含0.1%的DEPC的水浸泡过夜以便去器具上面沾染的RNA酶，浸泡后高温高压消毒。1000ml双蒸水中加入1ml DEPC，充分震荡混匀，配制成含
11、0.1%DEPC的水备用。含0.1%DEPC的水放置过夜，大概16小时后，吸取100ml，经高温高压30min后，即可除去DEPC，成为不含RNA酶的水。可用于RNA的提取和逆转录。(2)RNA酶的去除RNA酶可以降解RNA, 破坏RNA的完整性,影响试验结果，所以在提取RNA的整个过程都要严防RNA酶的存在。为减少RNA酶的污染，所用的Tip头、Eppendorf离心管等塑料制品均先用0.1%二乙基焦碳酸酯(DEPC水)浸泡过夜，后高压消毒除去残存的DEPC，进口塑料管已经过射线消毒，可直接使用；其它玻璃、陶瓷器皿均需先水洗晾干后，再经重铬酸钾-硫酸洗液浸泡过夜，洗净后200干烤4-6小时，
12、方能使用。所以物品均现配现用。(3)EtBr溶液的配制溴化乙锭EtBr是有毒物质，皮肤不可以直接接触，整个配置过程都要戴橡胶手套，在通风厨中进行。配置的溴化乙锭贮存浓度为10mg/ml，工作液的浓度为200g/ml。首先将溴化乙锭0.5g溶解于50ml三蒸水中，充分搅拌溶解后放置于棕色瓶中4避光保存。使用时取10mg/ml的贮存液200l稀释于10ml三蒸水中。（4）50TAE电泳缓冲液的配制Tris 12.1g0.5mmol/L EDTA(PH=8.0) 5.0ml冰醋酸 2.9ml首先称取Tris12.1g加入40ml三蒸水中，依次加入0.5mmol/L EDTA(PH=8.0) 5.0m
13、l，冰醋酸2.9ml，充分搅拌溶解后用三蒸水补足至50ml，高压灭菌后室温保存，作为贮存液。使用时，取20ml加蒸馏水至1000ml，即得1TAE的工作液。（5）不同浓度琼脂糖凝胶配制1.0琼脂糖凝胶 50ml琼脂糖 0.5g1TAE 50ml1.5琼脂糖凝胶 50ml琼脂糖 0.75g1TAE 50ml称取所需剂量的琼脂糖粉末，加入所需体积的TAE缓冲液中，置于微波炉中间断加热，使琼脂糖完全溶解，其间不断缓慢摇动锥形瓶，使贴于壁上的琼脂充分溶解。冷却至50左右，加入200g/ml溴化乙锭(EB液)125l混匀(使终浓度为0.5g/ml)。2 方法2.1试验前RNA酶的去除：采用Trizol试
14、剂一步法提取卵巢组织RNA：为减少RNA酶的污染，该方法中所用的Tip头、Eppendorf离心管等塑料制品均先用0.1%二乙基焦碳酸酯(DEPC水)浸泡过夜，高压消毒除去残存的DEPC。进口离心管已经过射线消毒，可直接使用；其它玻璃、陶瓷器皿均需先水洗晾干后，再经重铬酸钾-硫酸洗液浸泡过夜，洗净后200干烤46小时，方能使用。一般去除RNA酶的用具立即使用。人的皮肤是RNA酶污染的重要来源，用具处理过程中和试验过程中均主意戴手套和帽子。空气中含有RNA酶，去除RNA酶的用具需要用布包裹，容器需要盖上盖子，且不宜放置过久。2.1.2总RNA提取RNA是极易受到RNA酶的降解，在提取RNA过程中
15、最关键的是抑制RNA酶活性,所以的用具均需经过含0.1%DEPC的水浸泡过夜后高温高压消毒。RNA提取基本原理是通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。已经有商品化的RNA提取试剂盒出售，如美国Invitrogen公司的TRIZol和日本Takara公司的RNAiso。本试验采用美国Invitrogen公司的TRIZol试剂提取RNA。TRIZol为高浓度强变性裂解液，可迅速破坏细胞结构，使RNA从细胞中释放出来，同时Trizol试剂还含有Rnase抑制剂使细胞内RNA酶失活，RNA不被降解，同时氯仿能将细胞碎片、DNA、蛋白质与RNA分
16、离开来，得到纯化的总RNA，焦碳酸二乙酯(DEPC)是一种强烈的RNA酶抑制剂，用它来浸泡实验所用器具，及配制70%乙醇，保证实验过程不产生RNA酶污染，并且使所得RNA有较高的纯度，几乎不含有基因组DNA。实验步骤：本次研究采用美国Invitrogen公司生产的Trizol试剂一步法提取卵巢组织总RNA，以便得到高质量的RNA，对卵巢癌组织中的目的mRNA进行定量分析。具体步骤如下：(1) 从液氮罐内取出保存的卵巢癌组织，并逐一核对住院号和姓名，剪取约200mg卵巢癌组织迅速置于液氮中，在液氮中使用研钵将卵巢癌组织研磨成粉末后加入Trizol 试剂1mL，充分混匀。(2) Trizol充分溶
17、解后的卵巢癌组织浆转入1.5mL离心管中，加0.25mL氯仿，充分振荡混匀，冰浴15min。(3) 在4低温13000rpm，离心15min。(4) 小心吸取上层水相至另一1.5mL离心管中，RNA存在于上层水相，在吸取时注意不要吸到蛋白层或有机相，以免蛋白等杂质的污染。加等体积异丙醇，摇匀，室温放置10min，在4低温13000rpm，离心15min，沉淀RNA。(5) 加70%乙醇漂洗沉淀，在4低温5000rpm，离心10min，小心弃去乙醇，空气中干燥10min。(6) 加入40l 经DEPC处理过的，不含RNA酶的双蒸水完全溶解总RNA。2.1.3总RNA的定量及纯度测定：为了检测所提
18、取RNA的纯度和质量，使用紫外分光光度计测量RNA溶液的吸光值，并使用琼脂糖凝胶电泳检测条带。(1) 总RNA定量分析：用ddH2O稀释3LRNA样品至150L，充分混匀；用紫外分光光度仪测总RNA的OD260、OD280的吸光值，计算OD260/OD280比值，比值大于1.80，表明纯度符合要求，如低于此值，表明存在蛋白质污染，需重新用酚/氯仿抽提。通过OD260值计算RNA总浓度：总RNA浓度(ug/L)=(A260 40稀释倍数)/1000(2) 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性：选用专用电泳槽、制胶板、梳子，先用无水乙醇擦洗，晾干后用0.1DEPC处理过的ddH2O彻底冲洗，再用无水乙
19、醇洗一次，待乙醇挥发后即可使用。制备1琼脂糖凝胶，其中含有0.5g/ml的溴化乙锭以便使PCR产物在紫外灯下显色。取2L总RNA溶液加1L上样缓冲液点样，以5V/cm稳压电泳，紫外灯下可见28s、18s、5s三条rRNA的清晰条带，但是有时5s条带并不能总是理想的显示，本次研究所纳入的卵巢癌组织有些在液氮中保存时间很久，有些不能清晰的显示5s的rRNA条带。结果见图。Bio-rad凝胶成像仪成像，使用quality-one软件分析知其28S条带亮度是18S亮度的2倍。表明RNA提取的质量很好，可以用于本次研究。2.2逆转录cDNA2.2.1逆转录引物的选择：以提取到的总RNA作为模板，使用引物
20、和逆转录酶逆转录成cDNA.通常可以选用的引物有三种：1.胸腺嘌呤寡聚体Oligo（dT）182.随机六聚体引物random hexamer primer3.序列特异的引物sequence-specific primer细胞内的mRNA在3端为polyA，Oligo（dT）18作为引物与polyA互补，使用Oligo（dT）18作为引物能够将所提取的总RNA中含有polyA 的mRNA逆转录为cDNA，所得到的cDNA利于后续的PCR扩增基因全长，利于构建基因全长的载体，而且对于引物与总RNA的比例要求不严体，不需要对引物与总RNA的比例进行优化。随机六聚体引物为四种脱氧核糖核酸(A,T,G,
21、C)的随机组合，使用此引物逆转录的cDNA长短不一，随机六聚体引物与总RNA的物质的量的比例对所得到的cDNA长度有关键性的影响，提高引物与总RNA的比例能够得到较短的cDNA产物，通常小于500bp; 如果降低引物与总RNA的比例则使长的cDNA产物增长。因此实验前对随机六聚体引物与总RNA的比例进行优化是必要的。序列特异的引物则适用于单管RT-PCR(one tube),逆转录的引物是针对目的基因而设计的。Oligo（dT）18与随机六聚体引物适用于两管RT-PCR。(tow tube).本研究采用两管RT-PCR法，使用随机六聚体引物random hexamer primer作为逆转录引
22、物以便得到较多的cDNA产物。2.2.2逆转录酶的选择目前广为使用的逆转录酶是四种，具体如下：1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。2 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42。3Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+ 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大
23、部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。本次研究采用Fermentas公司的Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase，(M-MuLV RT),此酶具有低的RNase H活性,以便从较长的模板（最长可达13kb）中得到全长cDNA序列。2.2.3具体步骤详细叙述如下：所有操作均在冰上进行。在0.5ml Eppendorf管内加入以下反应体系：总RNA 0.5-5g随机六聚体引物random hexamer primer 1l RNase free水 至总体积 12l稍离心
24、混匀后，70反应5分钟，立即置于冰上冰浴5分钟依次加入以下各成分：5Reaction Buffer 4l10mMdNTP Mix 2lRNA酶抑制剂(RiboLock Ribonuclease inhibitor)(20u/l) 1l稍离心混匀各成分，由于使用了随机六聚体引物random hexamer primer ，故此步骤在25下反应5分钟。加逆转录酶M-MuLV(200u/l) 1l由于使用了随机六聚体引物random hexamer primer ，故此步骤首先在25反应10分钟，然后在42反应60分钟。7210分钟灭活逆转录酶迅速置于冰浴中5分钟，以防cDNA结合成双链-20保存。
25、质量检测：制作含有0.5g/ml溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，然后加入逆转录产物4l及上样缓冲液2ul，电泳使溴酚蓝前移2cm左右，凝胶成像分析仪可见较宽的电泳区带呈片状。2.3 TaqMan实时荧光定量PCR实验原理：定义：实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，可以对 DNA 、 RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理
26、的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外还可以对 PCR 产物或样品进行定性分析：例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及 SNP 检测等。 目前实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。原理：聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。而实时荧光定量 PCR 则是通过对 PCR 扩增反应中
27、每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图：Fig Threshold value curve and CT value曲线阈值与Ct值荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增
28、加，所以PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的
29、对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 CT 值。因此，只要获得未知样品的 CT 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。Fig Standardard curve实时荧光定量PCR的标准曲线实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与
30、双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。 SYBR Green I的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm 。 在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。 SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链 DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，
31、通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个 PCR 产物可以与多分子的染料结合，因此 SYBR Green I的灵敏度很高。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I得到定量结果。一般而言，探针法比染料法（如SYBR Green I）最广泛使用的TaqMan探针就是运用了这个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET
32、），因此探针完整时，检测不到该探针5端荧光基团发出的荧光。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5-3外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）将探针5端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。2.3.1 引物设计和内参基因的选择为了去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真
33、正差异,通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。内参基因扩增中的变化可以反映RNA产量、质量和/或cDNA合成效率的变化。选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是必须的。内参基因应具备的条件理想的内参基因应该满足以下条件:不存在假基因(pseudogene),以避免基因组DNA的扩增;高度或中度表达,排除太高或低表达;稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞),而且其表达量是近似的,无显著性差别;表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关;其稳定的表达水平与目标基因相似;不受任何内源性或外源性因素的影响,如不受任何实验处理措施的影响。排除内参基因的条件则为:在正常和异常的细胞/组织中的
34、表达存在差异;呈现细胞周期依赖的表达; 定位于X染色体。本次研究选择人beta-actin作为内参基因，可以满足以上条件。采用第二章已经建立起来到TaqMan实时荧光定量RT-PCR平台，设计的TaqMan探针和引物如下：引物名称序列(53)引物特征产物长度bpTERCC1ATACCCCTCGACGAGGATGAG第II外显子末端77ACAGTGGGAAGGCTCTGTGTAGA第III外显子始端FAM- CGGAATAAGGGCTTGGCCACTCCA-TAMRA第II与III外显子连接处ASERCC1CCAGCGGACCTCCTGATG第VII外显子末端151和79*CTCTTGATGCG
35、GCGATGAG第IX外显子始端FAM-AGGACTTCGTCTCCCGGTCTCTGGAAC-TAMRA第VII与IX外显子连接处TaqMan beta-actinGGCACCCAGCACAATGAA1898GGAAGGTGGACAGCGAGG18FAM-CAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TAMRA252.3.2引物和探针的溶解稀释由于合成后的引物Olig Primer 和Probe呈膜状附在管壁上，在使用前先瞬时离心，再轻轻打开管盖。加入灭菌的去离子水，稀释成100 mol/ml的贮存液，在使用前调整终浓度至所需的浓度，置于-20保存。在稀释成工作液时，使Primer的浓
36、度为50 mol/l，Probe的浓度为10mol/l。2.3.3标准品的构建与标准曲线的扩增将构建成果的质粒转化入大肠杆菌后提取质粒，按10倍浓度梯度依次稀释做为标准品，以此为模板制作标准曲线。每个标本均在三个反应体系中同时用三套引物进行扩增，每个标本重复三次。每次均同时设置3个标准曲线。每个组织标本的ERCC1的拷贝数除以其内参beta-actin的拷贝数，其商值作为统计分析的数值。标准品的构建详见第二章。2.3.4 TaqMan实时荧光定量PCR检测mRNA表达水平首先将整个反应条件进行优化，优化后的分析效率在95%105%，且相关系数在0.901.00之间，每个10倍的浓度梯度之间的C
37、t值相差在3.3左右，标准曲线的斜率在-3.0左右。在冰上溶解所需试剂，使用cool start技术避免非特异性扩增。TaqMan探针注意避光，配制过程中将PCR反应管用锡箔纸包裹避光。在冰上配制如下试剂：试剂体积（l）Taq酶(5Ul-1)0.2510PCR Buffer（Mg2+Free）5MgCl2(25mmoll-1)3dNTP Mixture(各2.5 mmoll-1)4模板质粒5Primer Forward（50 moll-1)1Primer Reverse（50moll-1)1TaqMan Probe(10mol/l)2.5无菌水加水至50lTaqMan荧光定量PCR反应温度和时
38、间控制：95预变性3min；94变性1min,60退火和延伸1min,荧光探测；45个循环；于10保存。TaqMan 实时荧光定量PCR程序设置Program for TaqMan Real-time quantitative PCR ( Draw by Jiang Sheng)每个标本均在三个反应体系中同时用三套引物进行扩增，每个标本重复三次。每次均同时设置3个标准曲线。2.4统计分析 根据临床资料，按照患者对化疗的反应性，将患者区分为化疗敏感组和化疗耐药组，使用成组t 检验比较ERCC1在化疗敏感和耐药组间的表达差异，取双侧，以=0.05为检验水准。以ERCC1 mRNA表达量的中位值为界
39、分为ERCC1高表达组和低表达组，对随访资料的生存分析采用Kaplan-Meier法。使用log-rank test对数秩检验对生存期进行统计检验。将可能影响卵巢癌患者化疗反应的因素进行Logistic多因素统计回归，将有关影响卵巢恶性肿瘤患者生存期的因素进行Cox比例风险回归模型分析。数据录入使用软件Microsoft Excel 2003, 统计数据处理使用软件SPSS13.5 for windows进行。3. 结果3.1病人一般资料所纳入的63例卵巢癌患者中位年龄49岁（27岁67岁）。根据国际妇产科联盟（Fdration Internationale de Gyncologie et
40、dObsttrique, FIGO）2000年修订的临床分期标准来判断临床期别，结果：I期4例（6.35%），II期6例（9.52%），III期45例（71.43%），IV期8例（12.70%）。纳入卵巢癌患者的临床期别Clinical stage of the included ovarian cancer patients期别例数构成比%I期46.35%II期69.52%III期4571.43%IV期812.70%总计63100%另，按世界卫生组织（World Health Organization，WHO）1973年制定的卵巢组织学分类法进行组织学的分类，结果如下：浆液性囊腺癌16例（2
41、5.40%），粘液性囊腺癌23例（36.51%），透明细胞癌7例（11.11%），子宫内膜样癌9例（14.30%），其它上皮性卵巢癌8例（12.70%）。纳入卵巢癌患者的组织学类型Histology type of the included ovarian cancer patients组织学分类例数构成比%浆液性囊腺癌1625.40%粘液性囊腺癌2336.51%透明细胞癌711.11%子宫内膜样癌914.30%其它上皮性卵巢癌812.70%总计63100%另，按世界卫生组织（World Health Organization，WHO）1973年制定的卵巢组织学分类法进行组织学的分级，G1高度
42、分化例（17.46%），G2中度分化20例（31.75%），G3低度分化32例（50.79%）。纳入卵巢癌患者的组织学分级Cell differentiation of the included ovarian cancer patients组织学的分级例数构成比%高度分化1117.46%中度分化2031.75%低度分化3250.79%总计63100%3.2 TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测mRNA使用构建好的TaqMan实时荧光定量RT-PCR平台检测卵巢癌组织中的ERCC1基因总量mRNA，缺失第8外显子的ERCC1变异剪接体的表达量，分析效率在95%105%，且相关系数在0.90
43、1.00之间，每个10倍的浓度梯度之间的Ct值相差在3.3左右，标准曲线的斜率在-3.0左右。加图 3.3 卵巢癌组织ERCC1表达与化疗敏感性的关系 63例患者中有34例（53.57%）对化疗敏感，其中11人的ERCC1 mRNA表达高于中位值，23人低于中位置；29例（46.43%）对化疗耐药，其中20人的ERCC1 mRNA表达高于中位值，9人低于中位置。耐药组的ERCC1表达水平明显高于敏感组。缺失第VIII外显子ERCC1变异剪接体的表达个体差异甚大，最高值是最低值的70倍，占ERCC1 mRNA总量比例变化亦甚大，从1.8%到70.5%。统计分析表明，缺失第VIII外显子变异剪接体的表达量与卵巢癌化疗反应性无关。在总量
