分子诊断第一章至第13章.docx

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1、第 一 章 绪 论分子生物学的定义：分子生物学（molecular biology）是研究核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能，并从分子水平上阐述核酸与蛋白质、蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系及其基因表达调控机制的一门学科。广义分子生物学：包括对核酸、蛋白质等生物大分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律。狭义分子生物学：偏重于核酸的分子生物学。主要研究基因或DNA结构与功能、遗传信息的表达及其调控机制等，也涉及到这些过程中相关蛋白质和酶的结构与功能的研究。分子生物学研究的内容：按照狭义分子生物学的定义，可将现代分子生物学的研究内容概括为：1.基因与基因组的结构与功能。

2、2.遗传信息的传递。3.基因表达调控机制。4.基因工程。5.结构分子生物。现代分子生物学的发展：DNA重组技术：工具酶的发现、DNA的体外连接、载体的构建。核酸分析技术：核酸杂交技术、DNA序列分析技术、PCR技术。基因组研究：人类基因组计划、模式生物基因组。基因表达调控：操纵子调控机制、真核基因调控方式、小分子RNA的研究。细胞信号转导研究：G蛋白偶联信号转导、各种受体分子的研究。技术应用成果：癌基因的发现、转基因技术、基因诊断和治疗、生物药物生产。分子生物学发展趋势：功能基因组学蛋白质组学生物信息学。医学分子生物学定义：定义：主要研究人体生物大分子的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展

3、的关系。研究内容：主要研究人体发育、分化和衰老、细胞增殖调控、三大功能调控系统（神经、内分泌和免疫）的分子生物学基础；基因结构异常或调控异常与疾病发生、发展的关系；基因诊断、治疗和预防；生物制药。在基础医学中的应用：在分子水平上对人的生理功能和病理机制进行研究；出现新的边缘学科分子生理学、分子药理学、分子病理学、分子遗传学、分子免疫学、分子病原学、分子肿瘤学、分子遗传学、分子神经科学等；各学科在分子水平上进行整合的趋势；形成“反向遗传学”研究途径。在疾病诊断中的应用：以核酸、蛋白质为分析材料；应用分子生物学技术分析基因结构、表达变化及功能改变；检测疾病基因的存在及状态；对遗传性疾病、传染性疾病

4、、肿瘤及其他分子疾病进行诊断。在临床治疗中的应用：正常基因导入细胞替代或补充缺陷基因；疾病基因的封闭、敲除；非目标基因产物的协同作用。分子诊断的理论基础：病原生物与感染性疾病：病原生物基因在人体内的复制病原生物基因与人体染色体整合，致宿主基因结构异常。基因变异与分子疾病：基因变异：单基因疾病、多基因疾病、线粒体遗传病、恶性肿瘤。基因多态性分析：疾病诊断和遗传咨询、器官移植配型和个体识别、多基因病的诊断、基因定位和疾病相关性分析。基因表达异常：mRNA表达量异常、mRNA转录及加工缺陷。第 二 章 核酸的结构和功能核酸：是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。核酸的分类及分布：

5、脱氧核糖核酸 ：90%以上分布于细胞核，其余分布于线粒体、叶绿体、质粒等。携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。核糖核酸：分布于胞核、胞液。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。第一节核苷酸的组成及结构一、核酸的化学组成 元素组成：C、H、O、N、P（910%）分子组成：碱基(base)：嘌呤碱、嘧啶碱；戊糖(ribose)：核糖、脱氧核糖；磷酸(phosphate)。核苷酸水解产物：核苷酸包括磷酸和核苷，核苷包括碱基和戊糖。二、核苷酸的结构1. 核苷的形成：碱基和核糖（脱氧核糖）通过糖苷键连接形成核苷（脱氧核苷）。核苷：AR, GR, UR

6、, CR 脱氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR核苷：戊糖与含氮碱基脱水缩合而生成。假尿嘧啶（）核苷的糖苷键不是C-N键，而是C-C键。2. 核苷酸的结构与命名：核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。 核苷酸：AMP, GMP, UMP, CMP 脱氧核苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP。体内重要的游离核苷酸及其衍生物：多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP；环化核苷酸：cAMP，cGMP；含核苷酸的生物活性物质：NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP。3. 核苷酸的连接：核苷酸之间以3,5-磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核

7、酸。三、核酸的一级结构定义：核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。核酸具有方向性，一端称为5-端，另一端称为3-端。第二节DNA的空间结构与功能一、DNA的二级结构双螺旋结构DNA双螺旋结构的研究背景：碱基组成分析 Chargaff 规则：A = T G C；碱基的理化数据分析 A-T、G-C以氢键配对较合理；DNA纤维的X-线衍射图谱分析。 DNA双螺旋结构模型要点 ：DNA分子是反向平行的互补双链结构； 骨架：-脱氧核糖-磷酸- 碱基：“挂”在主链骨架上。DNA分子为右手螺旋结构。螺旋直径为2nm，形成大沟及小沟。相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一

8、圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。维系键：疏水作用力，氢键。碱基堆积力：碱基平面之间的疏水作用力。氢键：垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对。碱基互补配对：A = T; G C；碱基互补配对是半保留复制的基础。DNA双螺旋结构的多样性二、DNA超螺旋结构及在染色质中的组装DNA的超螺旋结构：超螺旋结构：DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋：盘绕方向与DNA双螺旋方同相同。负超螺旋：盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。意义：DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。 原核生物DNA的高级结构DNA在真核生物细胞核内的组装：真核生物染

9、色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体。核小体的组成：DNA：约200bp 组蛋白：H1、H2A，H2B、H3、H4。真核生物中的核小体结构：DNA 双螺旋形成超螺旋结构，再与核内的蛋白质结合，形成核小体的结构。DNA 缠绕八聚体 1.75圈，然后与H1连接，形成串珠状结构。意义：有规律压缩体积，减少占用的空间。三、DNA的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。基因：DNA分子中具有特定生物学功能的片段。基因组：一个

10、生物体的全部DNA序列。因组的大小与生物的复杂性有关，如病毒SV40的基因组大小为5.1103bp，大肠杆菌为5.7106bp，人为3109bp。第三节 RNA的结构与功能RNA通常以单链形式存在，但也可形成局部的双螺旋结构。RNA分子的种类较多，分子大小变化较大，功能多样化。RNA的种类、分布：细胞质RNA：mRNA、tRNA、rRNA、胞浆小RNA；细胞核RNA：hnRNA、核酶RNA、SnRNA；线粒体RNA：mt mRNA、mt tRNA、mt rRNA。一 、信使RNAmRNA结构特点：1. 大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2甲基化，形成

11、帽子结构：m7GpppN-。2. 大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。帽子结构和多聚A尾的功能：mRNA核内向胞质的转位、mRNA的稳定性维系、翻译起始的调控 。编码区：mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组，在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸，这种核苷酸三联体称为遗传密码。功能：为蛋白质的合成提供模板。mRNA的功能：为蛋白质的合成提供模板。把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。二、转运RNAtRNA的一级结构特点 tRNA是分子最小(7090个核苷酸）；含 10-20% 稀有碱基

12、，如 DHU、y等；3末端为 CCA-OH(氨基酸臂）；5末端大多数为G；具有 TyC 。tRNA的二级结构三叶草形：氨基酸臂：DHU环、反密码环、额外环、TC环。3OH 端可以结合氨基酸，反密码环可以与mRNA上的密码子配对，将合适的氨基酸携带到合适的位置。tRNA的功能：特异性活化、转运氨基酸；识别mRNA密码子，参与蛋白质合成。命名原则：tRNATyr：可以和Tyr结合的tRNA；Tyr-tRNATyr：结合了Tyr的tRNA 。 tRNA的三级结构 倒L形三、核蛋白体rRNA是细胞中含量最多的RNA，占总量的80%。rRNA的功能：参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。rRNA的

13、种类（根据沉降系数）：真核生物：5S rRNA、28S rRNA、5.8S rRNA、18S rRNA原核生物：5S rRNA、23S rRNA、16S rRNA。核蛋白体的组成原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸18S1874个核苷酸蛋白质21种占总重量的40%33种占总重量的50%大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸120个核苷酸28S5.85S5S4718个核苷酸160个核苷酸120个核苷酸蛋白质31种占总重量的30%49种占总重量的35%四 、其他小分子RNA及RNA组学SnmRNAs：除了上述三种RNA外，

14、细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。snmRNAs的种类：核内小RNA、核仁小RNA、胞质小RNA、催化性小RNA、小片段干涉 RNA。snmRNAs的功能：参与hnRNA和rRNA的加工和转运。RNA组学：RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。 第 四 节 核 酸 的 理 化 性 质一、核酸的一般理化性质核酸具有酸性；DNA分子粘度大；RNA 分子粘度小； 能吸收紫外光，

15、最大吸收峰为260nm。可用于核酸的定性和定量测定。核酸的大小表示：碱基对bp；长度单位um；分子量Da；核酸的脆性。OD260的应用：1. DNA或RNA的定量：OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA（或RNA），20g/ml寡核苷酸。 2、判断核酸样品的纯度：DNA纯品：OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品：OD260/OD280 = 2.0二、DNA的变性定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：增色效应、粘度下降、比旋度下降、浮

16、力密度升高、酸碱滴定曲线改变、生物活性丧失。DNA变性的本质是双链间氢键的断裂。解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)。Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关， G+C的含量越高，则Tm越高。三、DNA的复性 DNA复性(renaturation)的定义：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的

17、双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火。减色效应：DNA复性时，其溶液OD260降低四、分子杂交与探针技术两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，在适宜的条件（温度及离子强度）下，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交。核酸杂交可以是DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交，RNA-RNA杂交。不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序。探针技术：利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射

18、性同位素或生物素进行标记。这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针。核酸分子杂交的应用：研究DNA分子中某一种基因的位置；定两种核酸分子间的序列相似性；检测某些专一序列在待检样品中存在与否；是基因芯片技术的基础。第五节 核 酸 酶核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。依据底物不同分类：DNA酶(DNase)：专一降解DNA。RNA酶 (RNase)：专一降解RNA。依据切割部位不同：核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。核酸外切酶：53或35核酸外切酶。核酸酶的功能：生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解。参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表

19、达过程；负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸；在消化液中降解食物中的核酸以利吸收；体外重组DNA技术中的重要工具酶。催化性RNA ：作为序列特异性的核酸内切酶降解mRNA。 催化性DNA ：人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。 第三章 基因组和基因组学基因定义：基因是决定一定功能产物的DNA序列（片断），是遗传的结构和功能单位。功能产物：RNA和蛋白质。染色体组：每个生殖细胞中的全部染色体称为一个染色体组。人体体细胞内含两个染色体组。基因组：每个染色体组的DNA构成一个基因组。广义的基因组包括细胞核染色体基因组和细胞质中的线粒体基因组。

20、是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质。基因组学：是指对所有基因进行基因组作图，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析。第一节 原核生物基因组原核生物的生命活动： 1） 可进行基因复制；2）复杂的代谢活动：（获取自身所需的能量、合成自身生长所需的原料）；3）适应环境的变化（调节自身的酶系统组成及功能、调节细胞内某种蛋白质的数量）一、原核生物基因组一般特征1）DNA较小，一般为106107碱基对、2）基因数目较少，大约为3500个基因、3)通常为一条环状双链DNA（dsDNA）、4)只有一个DNA复制起始点、5)GC含量差异很大，25%75%之间，可用于推测细菌的种类（一）原核生物的类核结构：1）

21、基因组DNA位于细胞中央的核区，无核膜；2）形成类核结构，中央为RNA和支架蛋白，外围是双链闭环的超螺旋DNA。（二）原核生物的操纵子结构：是指数个功能上相关联的结构基因串联在一起，连同上游的调控区（包括调节基因、启动子、操纵基因）以及下游的转录终止信号，共同组成的一个基因表达单位。（三）原核生物的结构基因：1）结构基因是连续的，无内含子成分；2）多顺反子结构；3）多数为单拷贝基因，编码rRNA、tRNA的基因为多拷贝；4）结构基因的编码顺序一般不重叠。基因重叠是指基因组DNA中某些顺序被两个及以上基因所共用（四）具有编码同功酶的基因：表达功能相同的产物的一类基因，但基因结构不完全相同。二、质

22、粒 指细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状DNA分子（一）质粒的结构及理化性质：1）环状双链超螺旋DNA分子；2）分子量4 1061 108D；3）可发生构象变化，出现超螺旋、半开环、线状三种构象；4）具有较强的抗切割和抗变性的能力。（二）质粒的命名与分类：命名：用p代表质粒，后面用两个大写字母代表作者或实验室名称及编号。如pUC118分类：可根据复制机制、功能、转移方式、大小以及对宿主的依赖程度不同进行分类。复制机制：严紧型质粒、松弛型质粒；质粒功能：F质粒（性质粒）、R质粒（抗药性质粒）、Col质粒（大肠杆菌素生长因子）；转移方式：结合型质粒、可移动型质粒、自传递型质粒；

23、质粒的宿主范围：窄宿主谱型质粒、广宿主谱型质粒。（三）质粒的生物学特性：1可移动性；2）自我复制的能力；3）携带筛选标记（抗药性基因、营养缺陷型基因、抗重金属基因、抗紫外线X射线抗性基因）；4）不相容性。三、可移动的DNA序列定义：又称转座因子或转座元件。是一类在细菌染色体、质粒或噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立DNA序列。是基因重组的一种方式。分类：可分为三类：插入序列、转座子、可转座的噬菌体（一）插入序列： 具有转座能力的简单遗传因子，长度一般小于2kb。IS因子只含有与转座有关的基因与序列。共同特征是在其末端都具有一段反向的重复序列（IR）。（二）转座子：每个转座子都带有3个基因：

24、一个是编码对氨苄青霉素抗性的内酰胺酶(-lactamase)基因，其它二个是编码与转座作用有关的基因（TnpA和TnpR）。（三）可转座的噬菌体：是一类温和型噬菌体，如Mu噬菌体。（四）转座子的遗传效应：引起突变、引入新的基因、基因重排第三节 真核生物基因组一、真核基因组一般特征1）细胞核基因组含有两份同源基因组（二倍体）；2）核外基因组可有多个拷贝、3）基因组庞大，但非编码序列占90%以上；4）转录产物为单顺反子；5）细胞核基因组存在重复序列；6）基因是不连续的断裂基因；7）线性双链DNA分子，眼型复制模式、8）分细胞核基因组和细胞核外基因组。（一）单顺反子结构：单顺反子：一个结构基因经过转

25、录生成一个单顺反子mRNA分子，翻译成1条多肽链。（二）断裂基因：真核细胞的结构基因内部大多由不连续的几个编码序列所组成，之间插入非编码的间隔序列；真核生物基因之间存在非编码区，称为间隔区DNA（spacer DNA），是结构基因彼此分开。内含子与外显子：1.内含子：是结构基因的非编码序列，与编码序列间隔排列。2.外显子:是结构基因的编码序列。基因转录后，剪去内含子，拼接外显子成为成熟的mRNA（三）重复序列高度重复序列：1）在真核生物基因组中普遍存在，约占10%60%，占人类基因组约20%；2）重复频率达106以上；3）重复片段10300bp ；4）复性速率高；5）可为反向重复序列或顺向重复

26、序列。反向重复序列：指两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列，其间可间插间隔顺序或无间隔顺序（又称回文结构），与基因表达调控有关。串联重复序列：1）指固定的重复单位头尾相连形成重复顺序片段；2）重复单位多为27bp组成；3）与主体DNA的碱基组成不同，用CsCl2密度梯度离心，可在主带的两侧出现小带，称为卫星DNA。卫星DNA ：1）大卫星DNA：根据浮力密度不同可分为、和、卫星DNA；2）小卫星DNA：位于端粒及端粒附近，显示丰富的限制性片段长度多态性；3）微卫星DNA：重复单位25bp，重复1060次，重复总长度150bp，存在于内含子、间隔DNA以及编码区中。目前已成为DNA分析的遗传

27、标记。高度重复序列的主要功能功能：1）参与复制水平的调节：反向重复序列常位于DNA复制起始点附近，是蛋白质和酶的结合点。2）参与基因表达调控：反向重复序列可形成发夹结构，转录到hnRNA分子中可稳定RNA分子免遭降解。3）参与转位作用：转位因子的末端包含反向重复序列。4）可作为DNA指纹反映个体特征。5）与染色体构象、着丝粒形成有关。中度重复序列：1）重复序列重复数十数万次；2）复性速度介于高度重复序列与低度重复序列之间；3）一般具有种属特异性，可作为DNA标记。4）大多不编码蛋白质，但中度重复序列有一部分是结构基因，如HLA、rRNA 、tRNA、组蛋白、免疫球蛋白等结构基因。低度重复序列

28、1）低度重复序列中在单倍体基因组中只出现一次或数次；2)占基因组50%80%；3）复性速度慢；4）贮存大量遗传信息。（五）端粒：端粒是位于染色体3末端的一段富含G的DNA重复序列，端粒和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物，广泛存在于真核生物细胞中，具有特殊的功能。（六）DNA多态性：i限制性片段长度多态性：分为两类：一类是由于限制性内切酶位点上发生了单个碱基突变，导致酶切位点的丢失或获得；一类是由于基因内部发生缺失、插入、串联重复序列拷贝数变化，导致酶切位点的相对位置发生改变。ii短串联重复序列：1）分布广泛，每隔1520kb就有一个STR位点，占基因组的10%；2）具高度多态性，是非常重要的遗传标

29、记；3）主要用途：制作人类基因遗传图谱的；目的基因筛选；个体识别和亲子鉴定；基因诊断。STR与疾病的关系：STR主要以三个核苷酸为重复单位，重复次数超过正常个体的上限，即可出现一些遗传性疾病。1）脆性X综合征：5非翻译区CCG拷贝数过度增加100次。（正常人中的CGG重复次数3聚合酶活性与延伸能力；3-5外切酶活性与校对功能（保真性）；5-3外切酶活性与切口平移。切口平移法：当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶就可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。同时该酶具有从53的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷酸。 切口平移的意义： 1）切除RNA引物，并利用聚合酶活性填补

30、缺口 2）DNA修复中发挥重要作用3）DNA探针标记拓扑异构酶： 1）拓扑异构酶可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。 2）拓扑异构酶可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。第二节 端粒DNA的复制端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它以其自身RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。 生殖细胞、胚胎细胞、肿瘤细胞具有无限增值能力， 体细胞为会衰老死亡第三节 DNA的损伤与修复DNA的损伤主要有以下类型：1 ）DNA的损伤与修复 2）插入或缺失 3）三、链交联、链断裂第四节 DNA突变一、 突变的概念：指基因结构的任何改

31、变不能恢复到损伤前的状态，形成了可以通过遗传的永久性改变，致使基因作用改变、表达产物改变、个体表型改变。 二、突变的方式 分为：自发突变、诱发突变在自然条件下发生的突变叫自发突变由人工利用物理因素或化学药剂诱发的突变叫诱发突变三、突变的类型1）根据基因结构的改变方式：可分为点突变和移码突变两种类型。2）根据遗传信息的改变：可以分为同义突变、错义突变和无义突变三种类型。3）突变型基因转变成野生型基因的过程叫回复突变。4）某一突变基因的表型效应由于第二个突变基因的出现而恢复正常时，称后一突变基因为前者的抑制基因。第五节 逆转录逆转录酶三种功能1）依赖RNA的DNA聚合酶活力2）核糖核酸酶H活力3）

32、依赖DNA指导下的DNA聚合酶活力三、逆转录的生物学意义：扩充了中心法则、有助于对病毒致癌机制的了解、与真核细胞分裂和胚胎发育有关、逆转录酶是分子生物学重要工具酶DNA复制的条件：1、DNA单链模板2、 引物：核酸片段 3、原材料： NTP 4、DNA聚合酶逆转录的复制条件：1、 RNA模板、CDNA第一链 2、 引物：tRNA、其他3、 tTPP 4、 逆转录酶RDDP、DNA聚合酶DDDP第六章 基因表达定义：将基因遗传信息以一定的方式反映到蛋白质分子的结构上来，这一过程叫做基因的表达。包括mRNA的合成（转录）和蛋白质的合成（翻译）两个过程。 第一节 转录一 定义：以DNA为模板，以4种

33、NTP为原料，在DNA指导的RNA聚合酶的催化下合成RNA的过程。转录的过程使DNA分子中的遗传信息被转录到RNA分子中。二 基本特征：选择性：因细胞功能的需要，转录在不同时间、不的空间只发生在部分基因。独立性：每个基因的转录相对独立控制。不对称：只转录基因中双链DNA分子的一条链的信息，称为有意义链，有意义链的互补链称为无意义链，是转录的模板链。转录时生成的RNA链与DNA模板链的碱基配对，即G-C、A-T、U-A。条件：与转录有关的DNA元件、RNA聚合酶、转录因子。三 转录模板 反意义链:指导转录作用的一条DNA链有意义链:无转录功能的一条DNA链.与mRNA序列一致四 结构基因 能转录

34、出RNA的DNA区段 编码链 5 GCAGTACATGTC3 模板链 3 cgtcatgtacag5 RNA链 5 GCAGUACAUGUC3 只有一条DNA链参与了转录五 RNA在DNA模板上的生物合成六 RNA聚合酶的特点：原核生物 细胞中只有1种RNA聚合酶，可参与合成mRNA、tRNA和rRNA。RNA聚合酶催化聚合反应时需要Mg2+或Mn2+。该酶无校正功能。真核生物 RNA聚合酶有三型，分别称为RNA聚合酶、（或A、B、C）。三型RNA聚合酶识别不同的启动子而分别负责转录不同的基因。粒体中有专一的RNA聚合酶。 七 原核生物的RNA聚合酶(DDRP) 如E. coli的RNA聚合酶

35、是由四种亚基组成的五聚体全酶：起始因子和核心酶原核生物的RNA聚合酶的作用亚基功能亚基其作用为识别并结合启动子，是细菌基因转录的起始因子亚基亚基能与底物NTP结合，催化形成磷酸二酯键亚基亚基主要结合于DNA模板链亚基亚基二聚体与调控序列结合，与转录频率相关真核核生物的RNA聚合酶种类 分布 合成的RNA类型 对-鹅膏蕈碱的敏感性 核仁 tRNA 不敏感 核质 hnRNA 低浓度敏感 核质 tRNA、5S RNA 高浓度敏感Mt 线粒体 线粒体RNA 不敏感转录的抑制剂抑制剂 靶酶 抑制作用利福霉素 细菌全酶 和亚基结合，抑制起始 链霉溶菌素 细菌核心酶 和亚基结合，抑制起始放射线素D 真核Po

36、l 和DNA结合，阻止延伸-鹅膏蕈 真核Pol 和RNA Pol结合与转录有关的DNA结构原核生物： 转录单位 启动子、结构基因、终止子转录子：在一个转录单位中含有多个结构基因，即操纵子结构真核生物： 转录单位 顺式调、 控元件启动子：是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，起始DNA转录。启动子本身不被转录。每一个基因均有自己特有的启动子。原核生物的启动子位置：在DNA上使RNA分子开始合成的第一个核苷酸标为+1，它的5上游标为（-），3下游标为（+）。在上游大约-10处有6个碱基的TATAAT保守序列，称为Pribnow框，约在-35处有TTGACA保守序列。三个功能区：结合部位：-

37、10序列是酶的紧密结合位点；识别部位：-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；1区：为RNA合成的起始点。真核核生物的启动子：TATA盒：又称为Hogness盒或Goldberg-Hogness盒，在-25-30bp处，具有转录的定量效应。GC盒：位于-40-110bp之间，含有“GCGCGG”序列，具有转录调控的作用。CAAT盒：位于-70附近，含有GGNCAATCT序列，决定转录起始的频率。CACA盒：位于-80-90bp处，其核心序列为GCCACACCC。原核生物启动子有两个明显的特征：即在DNA上有一个1520个核苷酸的二重对称区，位于RNA链结束之前，形成富含G-C的发夹结构。接

38、着有一串大约6个A的碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串的U。寡聚U可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。由rU-dA组成的RNA-DNA杂交分子的碱基配对结合力很弱，利于RNA链释放。真核生物的加尾信号在结构基因的最后一个外显子中有一段保守的AATAAA序列，此位点下游有一段GT或T丰富区，此区和AATAAA序列共同构成poly（A）加尾信号。mRNA转录到此部位后，产生AAUAAA和随后的GU（或U）丰富区，延长因子识别并结合该结构，然后在AAUAAA下游1030个碱基的部位切断RNA，并加上poly（A）尾。反应元件：一些信息分子的受体被细胞外信息分子激活后，能与特异的DNA序列结合

39、，调控基因的表达。由于能介导基因对细胞外的某种信号产生反应，被称为反应元件。通常位于启动子附近或增强子内。如糖皮质激素反应元件。增强子：是一段DNA序列，其中含有多个能被反式作用因子识别与结合的顺式作用元件，能增强邻近基因的转录。增强子可位于基因内、附近或与基因相隔较远，其作用无方向性及基因特异性，不受基因远近的影响。增强子主要通过改变DNA模板的螺旋结构、为DNA模板提供特定的局部微环境、或为RNA聚合酶和反式作用因子提供一个与某些顺式元件联系的结构等方式发挥作用。沉默子：指在增强子内含负调控序列，在真核细胞中对成族基因的选择性表达其重要作用。 转录因子：真核生物在转录时往往需要多种蛋白质因

40、子的协助。这些因子称为转录因子。反式作用因子 转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。真核生物基因在无转录因子时处于不表达状态，RNA聚合酶自身无法启动基因转录，转录因子是起正调控作用。八 转录过程：起始阶段、 延长阶段、终止阶段起始阶段：真核生物转录起始复杂，往往需要转录因子的协助。RNA聚合酶、的转录起始过程各不相同，所需转录因子也不一样延长阶段：RNA聚合酶沿模板链的35方向滑行，双链DNA解链，RNA链按53方向不断合成延伸，形成12个碱基对的DNA-RNA杂交链。转录的延伸：随着RNA链的延伸，RNA的5端脱离DNA模板链而游离出来，被转录的

41、DNA区段又重新形成双螺旋。终止阶段：不同生物，或不同RNA的转录终止机制不同第二节 转录后加工一 原核生物在转录时，从一个操纵子转录出来的是一个完整的RNA分子，称为初级转录产物。mRNA转录产物在合成后就能作为模板参与蛋白质的生物合成，一般不需要加工。tRNA和rRNA结构基因的初级转录产物则需要经过修饰和加工，才能成为具有生物功能的成熟分子。二 真核生物转录产物加工三 mRNA的加工mRNA的剪接：一个基因的外显子和内含子都转录在一条原始转录物RNA分子中，称为前mRNA，或核内异质RNA这些内含子顺序必须剪切并把外显子顺序连接起来，才能产生成熟的有功能的mRNA分子，这个过程称为RNA

42、剪接 四、剪切过程第一阶段剪接体的形成至少5种SnRNA特异蛋白质SnRNP，分别与5端的GU、3端的AG和分支点识别结合形成剪接体，催化磷酸之间的转移。第二步 两步转酯反应mRNA的帽结构功能：能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合；m7Gppp结构能有效地封闭RNA5末端，以保护mRNA免疫5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。mRNA的化学修饰：有的mRNA分子内部含有12个m6A，它们是在前体mRNA的剪接之前，由特异甲基化酶催化修饰后产生的。五 tRNA加工：剪切5端前导序列、3端尾序列、添加或修饰3CCA序列、剪切内含子、 碱基修饰1 、RNaseP：特异切除5端前导序列2、内切核酸酶F：切除一部分3端拖尾序列。RNaseQ、RNaseY、RNaseD、NaseBN等外切酶：切除3端剩余序列直至CCA。3 、添加或修饰3CCA序列：如果其中不含CCA序列，则继续将3端多余序列切完为止，然后再由tRNA核苷酸转移酶催化添加或修复CCA序列。4、tRNA前体的剪接：内切核酸酶催化进行剪切反应；连接酶连接外显子5 、化学修饰 甲基化生成甲基嘌呤；还原某些尿嘧啶成为双氢尿嘧啶；通过核苷内的转位反应使尿嘧啶转变为假尿嘧