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1、干细胞的体外培养,一、干细胞的概念,干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。,干细胞几个主要特征,具有自我更新能力与自我维持能力，可以无限增殖分裂。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有自我更新能力，以维持自身数目的恒定。既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应有修复能力，如骨髓间充质干细胞等。 干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂,4,干细胞的对称分裂和不对称分裂,对称分
2、裂 （symmetry division）,不对称分裂 （asymmetry division）,干细胞 分 化 细 胞,干细胞 分化细胞,干细胞几个主要特征,干细胞本身不是终末分化细胞；具有多向分化的能力（多能性或全能性），即可以分化发育成各种胚层组织的细胞（ES细胞），或可以分化成为本系统各谱系的细胞（特定组织干细胞，如造血干细胞）。,干细胞几个主要特征,干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，也就是说干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将ES细胞种植入小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。,在不同生长因子刺激下干细胞可表现出不同分化
3、潜能,干细胞几个主要特征,干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运保持为干细胞或分化为特定细胞。,二、干细胞的分类,1、按分化潜能大小来分类:全能干细胞（ Totipotent stem cell ）：能分化成所有组织和器官的干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。多能干细胞（ pluripotent stem cell ），具有分化出多种组 织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育 潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例 子，它可分化出至少十二种血细胞 。专能干细胞（ unipotent stem cell ），这类干细胞只能向 一种类型或密切相关的两种
4、类型的细胞分化，如上皮组织 基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。,2、根据来源来分: 来源于胚胎- 胚胎干细胞 ESC （Embryonic Stem Cell ） 胚胎性生殖细胞 EGC （Embryonic Germ Cell ） 来源于成体组织- 成体干细胞 ASC （Adult-derived Stem Cell ）,胚胎干细胞,指从着床前的胚胎内细胞团（桑椹胚）或原始生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克隆细胞系。它可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。为全能干细胞。,成体干细胞,是成体组织内具有自
5、我更新及分化一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。来源于成年组织或器官，一般具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞或单能干细胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。,3、根据干细胞组织发生的名称进行分类:,胎胎干细胞造血干细胞骨髓间质干细胞肌肉干细胞成骨干细胞内胚层干细胞视网膜干细胞胰腺干细胞,三、干细胞研究的历史情况,1959年，美国首次报道了通过体外受精（IVF）动物。 60年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其来源于胚胎生殖细胞（embryonic germ cells, EG细胞）,此工作确立了胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）是
6、一种干细胞。 1968年，Edwards 和Bavister 在体外获得了第一个人卵子。 70年代，EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的EC细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。1978年，第一个试管婴儿在英国诞生。,1981年，从小鼠胚泡内细胞团分离出小鼠ES细胞，并建立了小鼠ES细胞体外培养条件。将ES细胞注入小鼠，能诱导形成畸胎瘤。 1984-1988年，Anderews 等人从人睾丸畸胎瘤细胞系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的）细胞，称之为胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）。克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下分化形
7、成神经元样细胞和其他类型的细胞。 1989年，Pera 等分离了一个人EC细胞系，此细胞系能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的（比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜能是有限的。,1998年美国有两个小组分别培养出了人的多能干细胞： James A. Thomson在 Wisconsin大学领导的研究小组的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取 inner cell mass细胞，建立细胞株。 John D. Gearhart在 Johns Hopkins大学领导的另一个研究小组的方法是：从受精后59周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞( primordial germ
8、cell )，建立细胞株。1999年12月，美国科学家在美国科学院院刊报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人类的成体干细胞具有可塑性。1999年12月，干细胞研究进展被科学杂志评选为该年度世界十大科学进展之首。2007年日本的Yamanaka研究小组和美国的James Thomson 研究小组分别获得诱导多能性干细胞 （induced pluripotent stem cell，iPS细胞）。,至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：小鼠的胚胎干细胞（1981）金黄地鼠（1988）、貂（1993）、猪（1994，1997）、鸡（
9、1996）、恒河猴（1995）、绒猴（1996）。分离得到人的胚胎干细胞（1998），胚胎生殖细胞（1998），目前不断报道成年组织来源的的干细胞。,四、胚胎干细胞的体外培养,（一）技术原理基本原则：促进ES增殖的同时，维持其未分化的二倍体状态。有饲养层（feeder layer）培养法：以小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系（STO）或小鼠胚胎成纤维细胞（ Mouse Embryo Firbroblasts, MEF）制备饲养细胞单层，主要是利用其分泌的生长因子FGF和抑制干细胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保持干细胞在体外克隆而不分化。无饲养层培养法：利用各种能分泌抑制分化
10、因子的细胞制备条件培养基或在基础培养基中加入重组的LIF制备条件培养基。,（二）基本过程,饲养层细胞制备或条件培养基制备,胚胎的制备和培养,胚胎干细胞的分离,胚胎干细胞的培养,胚胎干细胞的鉴定,冻存与复苏,细胞克隆形态,碱性磷酸酶检测,核型的鉴定,分化能力的观察,嵌合能力的测定,1、饲养层细胞培养,小鼠胚胎成纤维细胞（ MEF）：取孕12.5-14.5 d鼠胚胎躯干，以植块培养法或分散细胞培养法制备，取第三代至第五代细胞作为饲养层细胞。STO细胞：按照一般已建细胞系培养方法。DMEM加10%小牛血清作为培养液。采用胎数多小鼠一次大量培养MEF冻存，用时复苏。,MEF和STO的优缺点：MEF分泌
11、促进胚胎干细胞增殖和抑制分化因子的能力比STO强，STO作饲养细胞时常需在培养基中加入LIF。MEF不能长期传代，需经常准备怀孕小鼠制备第三代至第五代细胞，STO则可长期传代培养。MEF不具耐药性，不能作为转染外源性基因的胚胎干细胞筛选用。SNL细胞为转染了neor抗性基因和LIF基因的STO细胞，可分泌足够的抑制分化因子，并因带有neor抗性基因可用于转基因胚胎干细胞筛选。胚胎干细胞培养过程中，死亡MEF或STO的染色体可能导致胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。不易获得纯的胚胎干细胞作为生化和分子生物学方面的分析。使用前如用丝裂霉素C处理，如清洗不彻底，残余的丝裂霉素C会影响胚胎干细胞的
12、增殖。,报道的人源性滋养层细胞：,人骨髓来源的间充质干细胞胎儿肌肉或胎儿皮肤细胞新生儿包皮成纤维细胞成人子宫内膜细胞人胎盘成纤维细胞人胚胎干细胞经体内分化获取的间充质干细胞,2、饲养单层制备,MEF或STO连成一片，以含10g/ml丝裂霉素培养液370C作用2-3 h（如细胞层较薄，也可缩短至30min-1.5h），或射线照射（剂量为30-100Gy）。弃含丝裂霉素培养液，PBS洗5次， 射线处理者不用清洗。消化细胞，制备悬液种植至用0.1%明胶处理过（0.1%明胶水溶液覆盖培养瓶表面，室温2h以上）的培养瓶，种植细胞数：MEF7.5104-105个/cm2，STO为5104个/cm2。培养至
13、细胞连成一片没有间隙（中间可补加处理过的细胞），制备好的饲养单层置培养箱，5天内使用，使用前换成干细胞培养液。,观察：好的饲养单层，细胞连成一片，无间隙，死亡细胞和杂细胞极少。MEF和STO产生的抑制分化因子一部分分泌到培养液中，一部分锚定在细胞外基质上。无间隙的饲养单层保证了胚胎干细胞都能与饲养层细胞接触而达到最佳效果。,3、用于培养胚胎干细胞的条件培养基,直接在胚胎干细胞培养液中加入重组的LIF，使终浓度为1000U/ml。Baffalo大鼠肝细胞株BRL条件培养基（BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干细胞分化的因子DIF。收集培养72h的培养液，过滤除菌，用前6-7份+3-4份
14、胚胎干细胞培养液，再添加8-10%胎牛血清。年龄 2-3周大鼠心肌细胞条件培养基（RH-CM）：分泌抑制胚胎干细胞分化因子。收集1-6代细胞培养液，过滤除菌，用前6份+3份胚胎干细胞培养液+1份胎牛血清。,4、胚胎干细胞的分离和培养,（1）培养液配制培养液要用超纯水或五蒸水，不能有细菌内毒素污染，水要现用现制。高糖DMEM作为基础培养基，葡萄糖浓度为（4.5g/L）：有助于囊胚贴壁、内细胞团增殖及胚胎干细胞集落形成。使用前还要添加-巯基乙醇（0.1mmol/L）或单硫甘油（ 0.15mmol/L）：保护细胞内酶和蛋白质中的巯基不被氧化，促进胚胎干细胞的贴壁和克隆形成。使用前要添加15%胎牛血清
15、：必不可少，但也有缺点。,血清缺点：成分复杂，不利于整合到胚胎干细胞基因组中外源性基因功能的测定；可能含有一些未知的促进胚胎干细胞分化的因子；含有微量的血红蛋白和内毒素，干扰胚胎干细胞生长。无血清胚胎干细胞培养液无上述缺点，但细胞贴附力不如有血清培养基。,（2）胚胎干细胞的分离,小鼠：母小鼠超数排卵交配（注射孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素）胚胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）的母小鼠取胚胎胚胎培养：培养皿内制备直径0.5cm左右露滴状培养液液滴，并覆盖透明石蜡油，胚胎置于液滴中培养胚胎干细胞分离：普通分离法、免疫外科法，弃除滋胚层细胞，获得内细胞团（inner cell mass，
16、ICM），并分散为3-4个细胞在一起的细胞团,人胚胎干细胞来源,a.自终止妊娠（5-9周人工流产）的胎儿中提取生殖母细胞( primordial germ cell )。,28,Gearhart法,29,b.取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。用这种方法，每个胚胎可取得1520个细胞用于培养。,Thomson法,c.通过体细胞核转移技术（SCNT技术）获取,30,其它干细胞的分离与纯化,干细胞表面有许多特殊的标记，以造血系统为例，干细胞的表面标志有Sca-1和c-kit等。另外各种成体干细胞还有各自独特的标记物，如人造血干细胞表现为CD34+和Thy10+而CD10，CD14，CD15，CD16，
17、CD19，CD20皆为阴性另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理特性，比如干细胞不被染料Hoechst33324和Rhodamine123染色。利用这些特性及表面标志，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。,（3）胚胎干细胞培养,有饲养层细胞培养：将内细胞团吸置处理过的饲养层上，一个内细胞团放置一个孔，370C、5%CO2、饱和湿度培养2d后出现小集落，并逐步增大，6-10d可消化传代，消化时，消化30s后弃消化液，残余消化液继续作用，当饲养单层出现裂隙（或显微镜下细胞之间分开），终止消化，一般为2-3min加适量培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种新饲养层扩大培养。无饲养层培养：
18、明胶包被培养板，条件培养基。已建系胚胎干细胞：将已培养2-3d生长旺盛干细胞消化成单细胞悬液，添加新的培养液，按照1：3或1：6比例转钟。,注意事项：最初分离的内细胞团以3-4个细胞团为宜，但集落形成后，传代过程中一定要消化成单细胞，否则胚胎干细胞会互相诱导，易于分化。培养条件要始终如一。为了增强胚胎干细胞粘附力，除明胶包被外，还可以用纤维连接蛋白和多聚赖氨酸等促进粘附。,（4）培养结果,hES细胞集落（10）,胚胎干细胞呈集落状（岛屿状）生长，边缘整齐，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清。消化成单细胞后细胞小而圆，核大，胞浆小。,A phase contrast image of
19、 the pluripotent murine embryonic germ cell,A culture dish containing hundreds of colonies of murine embryonic germ cells. Each red-stained spot represents an individual colony comprised of hundreds or thousands of stem cells.,5、胚胎干细胞的冻存和复苏,冻存液：胚胎干细胞培养液+10%-15%DMSO。冻存细胞密度：106-107个/ml冻存与复苏方法同普通细胞。LIF
20、条件培养基培养的细胞，仍然用不含LIF的胚胎干细胞培养液冻存。,（三）胚胎干细胞的鉴定,1、 ES细胞生物学特性（1）ES细胞形态结构及核型ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了二倍体性质。正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。,（2）ES细胞生长特性ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。 ES细胞增殖迅速，每1824 h分裂增殖 1次。此外，其还可以
21、在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。,40,人胚胎干细胞(hES)的特点,形态：圆形或椭圆，体积较小，核质比较大，体外抑制分化培养时呈鸟巢状，集落生长并紧密堆积，细胞界限不明显。,（3）ES细胞的高度分化潜能,ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分 化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。在单层培养时细胞自发分化成多种细胞， 悬浮培养中： “简单类胚体” “囊状胚体” 细胞分化物。ES细胞可进行诱导分化 *用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导90以上的ES细胞 分化为神经胶质细胞， *聚集培养的ES细胞
22、诱导分化则可分化为有节律性收缩 的心肌细胞。 *将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞 组成可代表3个胚层细胞。 *用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重 构胚和动物个体。,（4）碱性磷酸酶的表达,许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。,（5）胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达,早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA-1
23、）。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA-1的表达。小鼠SSEA-1的表达自8细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个标志。,2、ES细胞的全能性主要体现在以下几方面： 形成畸胎瘤。将ES细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞； 形成类胚体。培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目，能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种细胞系混杂的集合体、具有三个胚层组织；,直系分化。通过控制ES细胞生长环境，
24、或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3转人ES细胞，可使之分化为神经细胞； 形成嵌合体。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（chimera），ES细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为ES细胞的标准。,3、ES细胞的鉴定,- 细胞的形态结构- 核型分析- 碱性磷酸酶（AKP）染色- SSEA-I 免疫荧光标记- 分化能力检测 体外分化试验 体内分化试验 嵌合体形成试验 核移植试验,（1）ES细胞形态学鉴定 依ES细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克
25、隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）对ES细胞进行初步鉴定。,（2）核型分析 ES细胞具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验,（3）碱性磷酸酶（AKP）染色原理：AKP在碱性条件（pH9.0-9.6）下能使孵育液中的-磷酸奈酚钠水解，产生-奈酚，然后再与偶氮盐偶联，形成不溶性染料而呈现颜色。步骤：生长胚胎干细胞克隆的盖片以无水乙醇或冷丙酮固定10-15min水洗滴加孵育液室温5-10min水洗10min复染（甲基绿等） 10min。结果：未分化胚胎干细胞颜色以所用偶氮盐品种而异，分化者则为复染液颜色。对照：以已建系ES细胞（或小鼠的脱带桑椹胚或囊胚）作为阳性对照，作用液中不含-萘酚磷
26、酸钠为阴性对照。,（4）胚胎干细胞特异表面抗原的表达,免疫荧光检测SSEA胚胎阶段特异性抗原:SSEA-1 SSEA-3 SSEA-4 Thmoson分离的hES 阴性 弱阳性 强阳性Gearhart分离的hES 阳性 弱阳性 阳性小鼠ES 阳性 阴性 阴性鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异。RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达 Oct-4只限定在多潜能细胞中表达。人和小鼠的胚胎干细胞都表达转录因子Oct-4，当胚胎干细胞分化时，其表达能力大大降低。,52,（5）分化能力检测,体外分化能力观察:无饲养层和无抑制分化因子的条件下培养，胚胎干细胞会分化成各种细胞或发育成胚胎体：3d “简
27、单类胚体” 5-10d“囊状胚体” 贴壁细胞为细胞分化物。,体内分化能力观察：ES细胞接种同一品系小鼠腹股沟（107个细胞）或裸鼠、SCID小鼠（106个细胞）约2周后出现肿块，4-5周进一步增大，摘除肿块固定切片染色：见三个胚层组织，为畸胎瘤结构裸鼠和SCID小鼠可接种异种细胞和组织的移植也可接种腹腔，2-3周后观察肿瘤,嵌合能力测定：野灰色小鼠品系（如129鼠）ES注射白化体小鼠（BALB/c小鼠）或纯合非野灰色小鼠（C57BL/6小鼠）着床前胚胎内，或将来源于白化体小鼠的ES注射野灰色小鼠或纯合非野灰色小鼠着床前胚胎内，再移植到假孕母鼠子宫内，使之发育成个体。 如ES具有嵌合能力，则会融
28、合到宿主胚胎细胞中，并共同发育形成各种组织细胞并产生个体小鼠即为嵌合体，其毛色应是ES细胞来源品系小鼠和胚胎供体小鼠毛色的杂合，即有白色皮毛也有野灰色或黑色皮毛。 除毛色观察，也可检测同工酶遗传标记，或采用PCR和小卫星DNA方法等鉴定嵌合体。,六、成体干细胞,优点获取相对容易 源于患者自身的成体干细胞在应用时不存在组织相容性的问题，避免了移植排斥反应和使用免疫抑制剂 理论上，成体干细胞致瘤风险很低，而且所受伦理学争议较少 成体干细胞还具有多向分化潜能,但胚胎干细胞也存在自身的优势： 胚胎干细胞能永生化，可以传代建系，且增殖能力强，来源充沛。 虽然成体干细胞具有向多系分化的能力，但这种分化的“
29、效率”尚不理想。通过体外的扩增培养能提高转化效率，但是体外的转化是否会引起成体干细胞遗传变化还有待证实，而且这种分化是否是成体干细胞多系分化的结果尚无法肯定。成体干细胞和胚胎干细胞各有自身的优势和缺陷。同时开展对两者的研究，能互为裨益，相得益彰。两者的研究对干细胞领域而言都是必要的。,成体干细胞鉴定方法：科学家尚未就成体干细胞的鉴定标准达成一致，经常被采用的鉴定方法包括： 利用分子标记在活体组织中对细胞进行标记，然后确定它们所产生的特定细胞类型。 将细胞从活体动物上分离出来，在对其进行细胞培养的过程中进行标记，之后将细胞移植入另一个动物体内，观察该细胞是否可以再生其来源组织。 分离细胞，进行细
30、胞培养，并对其分化进行控制，通常采用加入生长因子或向细胞内引入新基因的方法，进而观察细胞的分化方向。,目前研究的成体干细胞 （Adult Stem Cells）Bone Marrow Heamatopoietic Stem Cells( HSC )Peripheral Blood Stem Cells ( PBSC )Fetal Liver Stem CellsUmbilical Cord Blood Stem CellsNeural Stem Cells,造血干细胞作为干细胞研究与应用的突破口,1. 造血细胞是细胞增殖分化的最佳模型。2. 造血干祖细胞及各系血细胞的表面标志较为清 楚，细胞表
31、型特征可进行定量分析，且可分选。3. 造血干细胞增殖及向各系分化的重要诱导因 子、受体、信号转导、微环境等因素较为清楚。4. 造血细胞发挥功能可相对游离，不需“生物支架”、 神经、血管、外科移植等复杂的“下游”工艺，因 此便于直接应用于临床。,神经干细胞(nural stem cell，NSC),NSC可增殖分化出中枢神经系统的三种基本细胞：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 神经干细胞的生化标记为巢素蛋白及波形蛋白。由于分离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，神经干细胞的研究仍处于初级阶段。,五、目前干细胞的研究热点,人体干细胞的建株；干细胞保持不分化的培养；干细胞的定向诱导分化；干细胞应
32、用的法律、伦理道德问题；干细胞、组织工程、器官工程；胚胎组织的种植及定向诱导分化。,六、胚胎干细胞研究的应用前景ES细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究中极有价值的工具；ES细胞是研究细胞分化的理想手段；ES细胞是研究基因功能的首选细胞；ES细胞作为生产转基因动物的主要途径之一；ES细胞治疗技术将引起一场医学革命；ES细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选。,Human Disease model,药物开发、毒性测试,临床医疗应用,基础医学研究,Human disease model,胚胎干細胞的基础医学研发与临床应用,来源于干细胞的组织可能用于治疗的疾病,细胞类型 治疗的疾病神经细胞 中风
33、、帕金森氏病、老年痴呆症、 脊髓损伤、多发性硬化病心肌细胞 心脏病发作、充血性心脏病产生胰岛素的细胞 糖尿病软骨细胞 骨性关节炎血细胞 免疫缺乏症、血液病、白血病肝细胞肝炎、肝硬化皮肤细胞烧伤骨细胞骨质疏松症视网(眼)细胞黄斑症骨骼肌细胞 肌肉萎缩症,干细胞治疗优点明显,低毒性（或无毒性），一次药有效； 不需要完全了解疾病发病的确切机理； 还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。用干细胞治疗疾病已不再只是设想。,革命性的机制转变,利用胚胎干细胞治疗疾病有广泛的应用前景，但是干细胞应用在欧美却受到社会伦理学的制约，并且在实际应用中还不能避免免疫排斥。因此横向分化的发现在干细胞研究中具有革
34、命性意义。它打破了用于临床治疗的干细胞只能来源于胚胎或受精卵的限制，为干细胞治疗疾病提供了新途径。人们可望从自体中分离出成体干细胞，在体外定向诱导分化为靶组织细胞并保持增殖能力，将这些细胞回输入体内，从而达到长期治疗的目的。,体外制造人体器官：比如通过形成嵌合体，在严格的控制下，使动物的某些器官来源于人体干细胞。这些来自人体干细胞的器官可应用于临床移植治疗；造血干细胞移植是目前治愈白血病和某些遗传性血液病的唯一希望，在肿瘤和难治性免疫疾病的治疗中也有其独特的作用。干细胞治疗应用于临床任重而道远。,NIH关于胚胎干细胞研究的指导原则,允许1.从人胚中获得新细胞系 2.使用私人资助、已经获得的来自
35、人胚的细胞系进 行研究 3.从胎组织中获得新细胞系 禁止 1.使用来自胎儿组织的细胞系进行研究 2.用干细胞创建人胚胎的研究 3.将人胚胎干细胞与动物胚胎结合的研究 4.使用干细胞进行生殖克隆 5.来自为研究目的而专门创建的胚胎的干细胞有关研究,去年考题,一、名词解释（每题3分，共30分） Contact inhibition；Nude mouse；NIH3T3；MTT test；Feeder Cells；Cell fusion；RPMI1640；Cloning efficiency；PCD；In vivo culture,二、简答题（每题6分，共30分）1简述HAT系统选择杂交瘤细胞的原理。2镜下观察组织培养细胞应注意什么？对经常出现的情况应如何处理？3. 简述一定浓度CO2对细胞培养的影响作用，应用CO2培养箱的注意事项。 4. 简述细胞转化实验中细胞选择的原则、常用细胞及转化因素 5比较胰蛋白酶和胶原酶生物学活性的异同。,三、问答题（每题10分，共40分）1试述现代组织细胞培养的主要标志性进展。2如何评价细胞培养技术在检测药物效应中的应用？3. 试述鉴定细胞是否具有恶性性质的常用技术有哪些？方法学如何？4解释说明图1和图2的含义，并进行比较。,图1,
