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1、实验室常用载体介绍,载体构建的基本原理,1. TA克隆 (T4连接酶) Promega 的T-easy载体（pGEM -T Easy ） TAKRA T载体(pMD18-T ) 2. TOPO TA克隆(pCR8/GW/TOPO) 定向克隆(pENTR) 3. 酶切连接 实验室常用 4. Gateway 技术,TOPO异构酶,Gateway 技术基于清楚了解的噬菌体位点特异重组系统(attB+attP ；attL+attR)。BP反应是DNA片段或者包含attB位点的表达克隆与包含attP位点的供载体（donor vector）之间进行的反应。BP反应产生入门克隆。LR反应是含attL位点的入
2、门克隆和包含attR位点的目的载体之间的重组反应。LR反应产生表达克隆。表达克隆包含目的基因和目的载体特异的启动子或者一些元件。,Gateway 技术,1. 创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。,2. 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway LR Clonase酶，产生表达克隆。,致死基因：DB 3.1,Gateway attB引物,attB1 5 - GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTNN - 3 attB2 5 - GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTN - 3,Proline rich pro
3、tein like protein (PRPL)Sense primer GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGAACATAAGCCCCCTGTCAntisense primer GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCATAAGCACTCTCGCTAGT,酶切连接载体,超表达 pCAMBIA2300S启动子 pBIN m-gfp5-ER和pBI121,Gateway技术载体,超表达,pGWB401pGWB501,pGWB402pGWB502,pGWB402pGWB502,可能都要做融合蛋白了，与gfp或者his标签，这样以后就可以做WESTER
4、N了。这边他们的超表达都是做的融合蛋白，不过要事先确定融合基因放在还是，免得影响其功能。如果不确定就两种同时做。,RNAi,启动子,启动子（截短策略）,attL1,attL2,pDONR201+promoter,棉花自己的启动子？,诱导表达,怎么工作的？我们怎么用？可以用在哪些地方？,loxP 34bp CRE geneGlucocorticoid GR intronEGFP,效率低的问题：,连接反应效率低？BP、LR反应效率低？转化效率低？切记抗生素,邓锋林负责载体的保管谭家福负责相关酶的管理每个人只给划平板,转基因过程中的注意事项,大小皿及滤纸不能混用转基因的共培皿及一些摇菌的三角瓶灭完菌再洗转基因所挑的克隆块，每个克隆块分化苗的棵数烟草转基因的假阳性问题（抗生素）拟南芥的转化公共卫生：到完皿之后， 继完代之后，配完培养基之后转基因苗移栽,
